急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI），为心肌组织血液供求失衡而导致的心肌缺血性损伤，由于冠状动脉闭塞而导致局部心肌发生坏死，大量心肌细胞凋亡[1-2]。AMI发生时，患者会发生剧烈的胸骨后疼痛，心肌酶异常升高，严重者常发生心力衰竭而危及生命[3-4]。异丙肾上腺素是一种β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor，β-AR）激动剂，大剂量注射异丙肾上腺素可引起心肌过度收缩，心率加快，冠脉痉挛而导致心肌持续缺血缺氧，继而发生AMI[5-7]。
AMI可归属于中医学的“胸痹”“真心痛”范畴，中医认为“胸痹”的病因多为“胸阳不振，气滞血瘀”，治疗多以“温经通阳，行气活血”为大法[8-9]。荆防颗粒是由古方荆防败毒散采用现代工艺制备而成的中成药，方中荆芥、防风可宣气机于外，柴胡、川芎可畅气机于内；枳壳、桔梗升降相因；茯苓、川芎血水同治；甘草、茯苓可扶益正气，诸药相伍可疏通气血，改善心脏供血功能，调整心脏缺氧状态。荆防颗粒对AMI的影响尚未见报道，本研究通过sc异丙肾上腺素建立大鼠AMI模型，观察荆防颗粒对AMI的保护作用，以期为临床上荆防颗粒防治AMI提供实验基础。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠40只，9周龄，体质量180～200 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，合格证号SYXK（京）2020-0033。实验期间动物均饲养于同一环境下，保持室温（25±1）℃，湿度55%～65%，12 h光暗循环，自由进食饮水，适应性喂养3 d后进行实验。动物实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准（批准号BUCM-4-2022040802-2009）。
1.2 药品与试剂
荆防颗粒（批号80022202002）由鲁南制药集团股份有限公司提供；盐酸异丙肾上腺素（批号901E021）购自北京拜尔迪生物技术有限公司；盐酸普萘洛尔（批号C12151281）购自北京正程生物科技有限公司；大鼠Na+, K+-ATP酶ELISA试剂盒（批号22061600）、Ca2+, Mg2+-ATP酶ELISA试剂盒（批号22061696）购自赛谱锐思（北京）科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号20220607）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号20220606）、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒（批号20220629）、还原性谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH）试剂盒（批号20220701）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒（批号20220606）购自南京建成生物工程研究所；二甲苯（批号10023418）购自国药集团化学有限公司；TUNEL试剂盒（批号11684817910）购自Roche公司；抗荧光淬灭封片剂（批号B0007）；兔源核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor red blood cell 2 associated factor 2，Nrf2）抗体（批号ab137536）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体（批号ab13238）、β-actin抗体（批号ab8206）；羊抗兔二抗（批号150016）购自英国Abcam公司；生理盐水（批号2202252008）购自石家庄四药有限公司。
1.3 仪器
FX-7200型全自动三通道六导联心电图机（北京福田电子医疗仪器有限公司）；Vevo 2100型小动物超声仪（Visuai Souics公司）；AU480型全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）；HC-2518R型离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；DY-2000型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；mμlISKANMK3型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；H-4000型免疫组化笔（上海鑫乐生物科技有限公司）；DS-U3型正置荧光显微镜成像系统（日本Nikon公司）。
2 方法
2.1 分组、造模及给药
将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、普萘洛尔（10 mg/kg）组和荆防颗粒低、高剂量（16、32 g/kg）组，每组8只。各给药组ig相应药物（10 mL/kg），对照组和模型组ig等体积的生理盐水，1次/d，连续14 d。第13天给药2 h后，模型组和各给药组大鼠sc盐酸异丙肾上腺素（85 mg/kg），对照组sc等体积的生理盐水，1次/d，连续2 d，以心电图ST段显著弓背抬高代表造模成功[10]。
2.2 心脏超声检测
大鼠ip 10%水合氯醛麻醉后备皮固定，通过配备10 MHz线性阵列超声换能器的Visual Sonics Vevo 2100超高分辨率小动物超声成像系统对大鼠进行超声心动图检查。分别测量左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic internal diameter，LVESD）和左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic internal diameter，LVEDD），计算左心室射血分数（ejection fraction，EF）和短轴缩短率（fractional shortening，FS）。
2.3 心脏指数分析
实验结束后，麻醉大鼠，取血并分离血清；迅速取出心脏，用冰冷的生理盐水洗去残留血液，剪去大血管及结缔组织，用滤纸吸干后称定质量，于−80 ℃冰箱保存备用，计算心脏指数。
心脏指数＝心脏质量/体质量
2.4 心肌组织病理学观察
各组大鼠心脏于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚度为4 μm），进行苏木素-伊红（HE）染色，于显微镜下观察各组大鼠心脏组织的病理变化。
2.5 心肌梗死率测定
取各组大鼠心脏，垂直于心脏长轴方向将左心室横断切成5片，置入1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chlorinated，TTC）溶液中，37 ℃避光孵育15 min。灰白色为梗死区（infarcted areas，IS），红色为非梗死区（non-infarcted areas，NIS），计算心肌梗死率。
心肌梗死率＝梗死区域面积/左心室面积
2.6 血清心肌酶活性和血脂水平的检测
各组大鼠麻醉后，腹主动脉取血，4 ℃、3500 r/min离心10 min，取血清，采用全自动生化分析仪检测血清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）活性及总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。
2.7 心肌组织中氧化应激指标和Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的检测
取各组大鼠心肌组织，匀浆后取上清液，按照试剂盒说明书测定SOD、CAT、Na+, K+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶活性及MDA、GSH、ROS水平。
2.8 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
取各组大鼠心肌组织，于4%多聚甲醛中固定，双蒸水冲洗，石蜡包埋，制备厚度为2～3 μm的切片，滴加TUNEL反应液孵育60 min，滴加DAPI覆盖细胞以复染核，滴加抗荧光淬灭剂封片，于显微镜下观察凋亡阳性细胞，并计算凋亡率。
凋亡率＝TUNEL阳性细胞数/总细胞数
2.9 Western blotting检测心肌组织中Nrf2和HO-1蛋白表达
取各组大鼠心肌组织，加入RIPA裂解液，提取总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%牛血清白蛋白中封闭，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤后，加入二抗，于37 ℃孵育120 min，TBST洗涤3次后，加入ECL发光试剂显色，使用Image J软件分析条带的灰度值。
2.10 统计学分析
采用SPSS 26.0软件进行统计分析，结果以表示。多组间数据的比较当方差齐时用单因素方差分析法（One-way ANOVA），事后多重比较采用LSD法；方差不齐时用Dunnett’sT3法。
3 结果
3.1 荆防颗粒对AMI大鼠心电图参数的影响
在麻醉状态下对大鼠进行心电图检测，如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠ST段显著升高（P＜0.01），表明造模成功；与模型组比较，各给药组大鼠ST段均显著降低（P＜0.01）。表明荆防颗粒对AMI大鼠的心脏具有保护作用。
3.2 荆防颗粒对AMI大鼠心脏功能的影响
超声心动是检测大鼠心脏功能的重要指标。如图2和表1所示，与对照组比较，模型组大鼠的EF和FS显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠EF和FS均显著升高（P＜0.05、0.01），且呈剂量相关性。
3.3 荆防颗粒对AMI大鼠心脏形态及心脏指数的影响
如图3所示，对照组大鼠心脏外观表面光滑，色泽红润；模型组大鼠颜色灰白，心尖区可见明显的缺血灶；各给药组大鼠心脏外观红润光滑，表明荆防颗粒可显著改善心肌缺血。与对照组比较，模型组大鼠心脏指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠心脏指数显著降低（P＜0.01）。图片
3.4 荆防颗粒对AMI大鼠心肌组织病理变化的影响
如图4所示，对照组大鼠心肌细胞形态规则，排列紧密，未见炎性细胞浸润和充血水肿；模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，间质水肿，可见大量炎性细胞浸润和不同程度的心肌细胞坏死，且有明显的胶原纤维和结缔组织增生；普萘洛尔组大鼠心肌细胞排列较为有序，可看到较多的炎性细胞浸润，间质水肿变形；荆防颗粒高、低剂量组大鼠心肌细胞排列规则，部分心肌细胞增大，有少量的炎性细胞浸润，心肌纤维化较模型组明显改善。表明荆防颗粒可有效改善盐酸异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌组织病理变化。图片
3.5 荆防颗粒对AMI大鼠心肌梗死面积的影响
如图5所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌梗死率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠心肌梗死率均显著降低（P＜0.05、0.01）。
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3.6 荆防颗粒对AMI大鼠血清中LDH、AST、CK-MB活性及LDL、HDL、TC、TG水平的影响
如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清中LDH、AST和CK-MB活性均显著降低（P＜0.01）。表明荆防颗粒能在一定程度上减轻心肌损伤程度。
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如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠血清中LDL-C、TC和TG水平均显著升高（P＜0.01），HDL-C水平显著降低（P＜0.01），表明造模后机体出现血脂异常状态；与模型组比较，各给药组血清中LDL-C、TC和TG水平均显著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C水平显著升高（P＜0.01）。表明荆防颗粒能有效减轻AMI大鼠血清中血脂异常状态。
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3.7 荆防颗粒对AMI大鼠心肌组织中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平的影响
氧化应激是AMI发病的重要机制之一，通过测定各组大鼠心肌组织中SOD、CAT活性及MDA、GSH、ROS水平来反映机体的氧化应激程度。如表4所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中ROS和MDA水平显著升高（P＜0.01），SOD、CAT活性及GSH水平显著降低（P＜0.01），表明机体过氧化程度加重。与模型组比较，各给药组大鼠心肌组织中ROS和MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01），SOD、CAT活性及GSH水平显著升高（P＜0.05、0.01），表明荆防颗粒能够降低AMI大鼠心肌组织中氧化应激水平，提高机体抗氧化能力的水平。
3.8 荆防颗粒对AMI大鼠心肌组织中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性的影响
Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶是维持细胞内Ca2+浓度的重要酶，其含量的高低可间接反映心肌细胞的损伤程度。如表5所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠心肌组织中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性均显著升高（P＜0.01）。表明荆防颗粒可有效恢复AMI大鼠心肌组织中Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性，减轻心肌损伤。
3.9 荆防颗粒对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响
如图6所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.01），提示机体造模后细胞凋亡程度增加；与模型组比较，各给药组大鼠心肌细胞凋亡率均显著降低（P＜0.01）。表明荆防颗粒能够有效减轻AMI大鼠心肌细胞凋亡。
3.10荆防颗粒对AMI大鼠心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达的影响
如图7所示，与对照组比较，模型组大鼠心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05、0.01）。表明荆防颗粒可能通过调控Nrf2/HO-1通路来减轻机体氧化应激和细胞凋亡水平，减轻心肌缺血损伤。
4 讨论
AMI是临床常见的一种急性缺血性心脏病，其发病率逐年上升，严重威胁着人类的生命健康[11]。目前AMI的主要治疗手段是血管成形术和溶栓治疗后对缺血区域进行再灌注，然而血运重建法对心肌细胞可造成进一步的损伤，严重者可诱发心力衰竭，这需要寻找新的预防和治疗AMI的药物。异丙肾上腺素是一种合成的儿茶酚胺[12]，其诱发的AMI模型与临床患者发病相似，且具有简单方便、动物死亡率低、模型稳定等优点，因此异丙肾上腺素诱导的AMI可作为用于心脏保护药物的开发和研究的标准化模型[13]。
AMI可归类为中医“胸痹”范畴，治疗以“温经散寒，理气活血”为主。荆防败毒散[14]首载于明代张时彻《摄生众妙方》，方中荆、防与二活开表透外；前、柴二胡枢利出入气机；枳壳、桔梗提壶揭盖，升降上下之气机；茯苓、甘草补脾利水以安五脏，诸药合用可以促进气机流转，开上导下，升清降浊，推动脏腑的新陈代谢，可有效缓解人体气血瘀滞状态，对心脏发挥保护作用。现代药理学研究也证实了荆防败毒散具有很好的活血化瘀、解热、镇痛、抗炎作用，已广泛应用于治疗外感内伤各科疾病[15]。
在心脏疾病中，心电图是临床最常用的检测手段，当AMI发生时，会出现心电图ST段的特异性改变，故ST段的变化幅度可基本反映心肌梗死的严重程度。超声心动也是检测心脏功能的重要手段，超声心动中的EF和FS常作为心脏功能检测的重要指标，当心肌发生缺血损伤时，EF和FS会低于正常值。本研究发现，模型组大鼠心电图ST段显著抬高（＞0.2 mV），EF和FS显著降低；荆防颗粒可显著降低心电图ST段的抬高，并明显升高了EF、FS值，表明荆防颗粒具有正向肌力作用，可减少异丙肾上腺素对心肌的损伤。
当心肌发生缺血梗死时，心肌细胞膜遭到破坏而使心肌酶释放到血液中，其中CK-MB、LDH和AST活性可以反映缺血损伤的程度。此外，血脂异常是心肌梗死发病最常见的危险因素，脂质代谢异常导致脂质在动脉内膜的沉积，进而促进心肌梗死的发生[16-17]。能量供应不足是心肌细胞损伤的重要因素，心肌细胞内Ca2+浓度升高可使心肌收缩力和需氧量增加，心肌的过度收缩可导致ATP降解，最终导致心肌细胞损伤[18]。心肌细胞膜上的钠钾泵和钙镁泵在维持细胞内Ca2+浓度方面具有重要作用[19]，其活性降低可引起细胞内的Ca2+超载，进而引起心肌细胞的凋亡，异丙肾上腺素可通过激活腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷-蛋白激酶A（adenylate cyclase-adenosine cyclophosphate-protein kinase A，AC-cAMP-PKA）信号转导通路而介导钙通道的磷酸化，进而使Ca2+内流增加导致钙超载。本研究发现荆防颗粒可以降低血清中心肌标志酶（CK-MB、LDH、AST）活性和TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，并且增加Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活性来发挥心脏保护作用。
氧化应激在AMI发病过程中发挥着重要作用，大剂量重复使用异丙肾上腺素会诱导自由基介导的脂质过氧化，从而通过缺氧、钙超载和心肌细胞膜丢失来增强心肌细胞中的氧化应激反应[20-21]。心肌细胞在病理过程中会产生大量的ROS，对细胞膜内的蛋白质和DNA造成氧化损伤，并最终导致能量代谢发生变化，继而引起细胞坏死和凋亡[22]。MDA是ROS的一种稳定代谢物，是作为多不饱和脂肪酸过氧化而产生的一种氧化应激标志物，急性缺血损伤引起的低氧水平和氧化应激可导致MDA在心肌中积累[23]。SOD、MDA、GSH和CAT等自由基清除酶是抗氧化系统的第一道防线，SOD通常存在于质膜中，其活性降低是氧化应激的显著标志。GSH通过减少过氧化氢和脂质过氧化来保护细胞膜免受氧化损伤。CAT是一种四聚体血红蛋白，可作为去除过氧化氢的催化剂。本研究结果显示，荆防颗粒显著增加心肌组织中SOD、CAT活性及GSH水平，降低ROS和MDA水平，说明荆防颗粒可以提高体内抗氧化酶活性，对抗自由基引发的脂质过氧化反应，保护缺血心肌细胞[24-25]。
细胞凋亡是异丙肾上腺素诱导AMI的主要病理机制，可导致缺血区和缺血边界的心肌细胞死亡，进而发展为AMI，并最终引发心力衰竭[26]。细胞凋亡是由多基因控制，通过信号传导通路介导的复杂过程。多项研究表明，Nrf2/HO-1是维持心肌细胞氧化还原稳定的重要信号通路。Nrf2是一种与氧化还原相关的转录因子，对氧化损伤有保护作用。在生理状态下，Nrf2与其抑制剂Keap1作为异二聚体结合在细胞质中，在缺血缺氧条件下，Nrf2与Keap1分离后进入细胞核，与细胞内的抗氧化反应元件（anti-oxidant response element，ARE）结合，进而上调HO-1及相关抗氧化基因的表达，从而抑制细胞凋亡。本研究结果表明，荆防颗粒可显著降低AMI大鼠心肌细胞凋亡，上调心肌组织Nrf2和HO-1蛋白表达水平，表明荆防颗粒可以激活Nrf2/HO-1通路，从而抑制细胞凋亡，减轻心肌缺血损伤。
综上所述，荆防颗粒能够通过减少心肌梗死面积、降低心肌酶活性、增加自由基清除酶活性、抑制细胞凋亡，从而发挥对急性缺血心肌损伤的预防性保护作用，其作用机制可能为通过激活Nrf2/HO-1信号通路来调控氧化应激和细胞凋亡。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：董利洋，程国良，姚景春，曹天佑，李小鹏，屈会化，孔 慧，赵 琰，张贵民．荆防颗粒对异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌梗死的保护作用研究 [J]. 中草药, 2022, 53(21): 6785-6794 .
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