背景：
1992年在世界范围内被认为是人类肝细胞治疗的“元年”。1992年12月，日本发表了第一份临床报告，描述了一种基于自体细胞的方法治疗10例终末期肝硬化患者。Strom和Fisher博士在1992年首次分离并注射同种异体肝细胞来挽救一名暴发性肝炎患者。这种成功的治疗方法使得急性和先天性肝病的治疗可以在之后的数年内保持相似。遗传代谢性肝病的主要适应证仍然是治疗，异体完整细胞提供的长期接受和代谢支持可以纠正代谢缺陷。此外，细胞疗法也被认为是挽救暴发性肝炎或急性肝衰竭患者的重要支持疗法，是实体器官移植的替代方法，或者是等待匹配供者的患者的临时支持。30年后的今天，肝细胞移植已经为不超过150名患者提供了服务。许多阻碍肝细胞大扩散和肝细胞移植的障碍需要数年的时间才能解决。虽然已经取得了重大成就，但在肝细胞移植或一般细胞疗法治疗肝脏疾病方面，仍存在限制其大规模推广的障碍。仍然存在的显著性障碍包括供体组织(作为细胞来源)的数量和质量有限。人们提出并研究了几种细胞产品，它们从胚胎和围产期组织发展到体细胞和患者来源的细胞产品。正是在这条临床前路径上，Cardinale及其合著者提供了一种可能有趣的祖细胞来源，这种祖细胞能够替代受损或缺陷的肝细胞。
简介：
2022年10月28日，来自瑞典卡罗林斯卡医学院病理学系的Roberto Gramignoli教授课题组在Journal of Hepatology（IF: 30.1）杂志上发表题为“New Cell-based Approaches for Liver Disorders: from Experimental to Validated Clinical Treatment”的文章[1]。
主要结果：
细胞移植是一项不断快速发展的平台化技术。如果干细胞来源的肝细胞样细胞被确认安全且有功能(就肝脏分泌和代谢途径而言)，则干细胞来源的肝细胞样细胞有可能提供一种无条件的细胞来源，可迅速被现有操作吸收。到目前为止，并不是所有提出的祖细胞或多能干细胞都适合和有效地治疗(或治愈)等待名单上的患者。在过去几年中，一些研究小组和公司提出了干细胞作为替代解决方案，其局限性是遗传和表观遗传不稳定性，但更相关的是，其局限于肝脏成熟水平。虽然所有的干细胞和祖细胞都值得研究，但来自前肠内胚层的祖细胞可能代表了研究的第一线。这些细胞可能合理地配备了分子和转运蛋白，并且在表型上更接近肝实质细胞(或者假设能够在较短的时间内达到完全成熟)。Cardinale和同事在胆道分析和祖细胞提取方面有丰富的经验，在本研究中，他们利用这一专长研究了另一种以前肠内胚层起源为特征的组织：十二指肠黏膜下腺体。
作者开发了一种分离EpCAM阳性细胞的方法，并将分离与免疫学分析相结合，以确定这些祖细胞是否能够获得肝细胞样表型。Cardinale等分离出的肝外祖细胞具有一定程度的同质性(由静态表面标志物决定)，并且具有向肝脏成熟进展的遗传能力。有趣的是，已经发现硫酸角蛋白相关抗原(肿瘤排斥抗原1-60)在这些祖细胞上表达。值得注意的是，TRA-1-60和TRA-1-81主要用于多能干细胞，如胚胎或诱导多能干细胞，但也用于围生期干细胞。然而，这些表面结合分子的作用机制仍有争议，并且它们在肝成熟中的相关性尚不清楚。
除了最初的成功之外，过去几十年也有几次尝试，给予或植入同种异体细胞，有时产生了轻微的短期效果。报告的校正水平或结局差异主要归因于供者细胞的质量。根据《药品生产质量管理规范》(Good Manufacturing Practice, GMP)的要求对原代肝细胞分离工艺进行了优化，并对最终细胞制品进行了广泛研究，以生成肝细胞特异性释放标准，并在输注前进行验证。但用于临床移植的原代肝细胞仍然是公认的主要负担。长期以来，器官移植排斥反应的肝脏一直是肝细胞的主要来源。此外，从排斥器官中分离出的人肝细胞的产量和质量受到长期缺血和微/巨脂肪变性的严重阻碍。此外，从这些组织分离出的肝细胞表现出肝脏活性降低，并且有时数量不足，无法达到对单个成人患者足够的细胞剂量。此外，研究者还研究并验证了从接受原位肝移植的患者身上切除的器官。许多类型的先天性代谢病的肝脏在生物化学和形态学上均正常，但疾病特有的功能受损除外，并且很少发生缺血或脂肪变性损伤。重要的是，从切除的肝脏分离并输入患者体内的细胞数量不足以转移供者的疾病。但移植的肝脏也不是丰富的肝细胞来源，不足以满足临床需求。因此，对产前(胎儿)和新生儿供者进行了研究。遗憾的是，尽管这些年轻细胞或祖细胞对低温保存毫无疑问具有耐药性，且免疫学特征较差，但数量有限，并增加了细胞治疗的另一重要风险:供体细胞可能无法成熟为有功能的肝细胞，并为受体提供所需的合成或酶活性。当提出用肝细胞或异位祖细胞/干细胞替代成熟肝细胞(例如十二指肠黏膜下腺源性细胞)时，也需要考虑类似的问题。在本研究中，吸引人的是这些十二指肠黏膜下腺体来源的祖细胞能够为逆转慢性(而非急性)肝损伤提供支持。作者正确地将这种能力与潜在的旁分泌介质相关，而不是直接成熟为有功能的肝脏表型。最近的证据表明，祖细胞成熟为组织特异性表型并不总是必需的或严格必要的。基于抗炎、ECM重塑、抗凋亡和促血管生成特性的旁分泌作用可能足以恢复纤维化组织的正常结构和功能。
将基于细胞的新方法过渡到临床实践需要通过相关的临床前验证。人体相关的临床前模型的实施对于评估产品的有效性和安全性至关重要。第一次临床前试验和第一次人体肝细胞移植之间的15年证实了这一实验步骤是至关重要的。作者在脂肪肝实验模型中检测了人十二指肠祖细胞，观察其对肝再生的支持作用。
另一个关键因素是细胞植入，而临床前分析有助于验证新产品。临床前模型的植入是供体细胞外渗能力和实质整合特征的有效预测指标。人的上皮细胞，如成人或儿童的肝细胞，体积大(直径约20 ~ 40μm)，一旦进入门脉血液，就会栓塞入血管根，导致可逆性高血压和(轻度)缺血再灌注损伤。这种对微血管的作用刺激内皮细胞的窗孔扩大，但也激活驻留在组织中的巨噬细胞，对循环系统中的残留细胞或细胞成分进行快速、有效的吞噬。作为安全性和临床前验证的一部分，通常需要对供体细胞的分布和植入进行评估。事实上，一些干细胞一旦被注入血液，就很难植入肝实质。通过门静脉输送的肝细胞有效地植入肝脏或被库普弗细胞切割，而较小的细胞则穿过器官并迁移到肝外室。这一关键步骤对于确定要给予受者的效应和细胞剂量非常重要。
图1：基于肝细胞的疗法目前的局限性和提出的解决方案示意图
临床结果与细胞剂量直接相关。在临床实践中，这种细胞剂量易于计算，通常根据患者的大小进行调整。在过去几十年中，使用的剂量为每kg患者体重106 ~ 107个活细胞。低细胞剂量已用于受暴发性肝炎和终末期肝硬化影响的患者。当需要治疗先天性代谢缺陷和逆转病理生理效应时，需要做一个很大的区别，即1或2个对数差异。为了纠正代谢失衡，需要肝脏嵌合体(约5 ~ 10%的肝实质被完整的细胞取代)。考虑到平均一个肝脏器官包含约15 ~ 20亿肝细胞，因此需要植入80 ~ 150亿完整的细胞来逆转代谢缺陷(如尿素循环缺陷或Crigler-Najjar缺陷)。据报道，每个供者都提取了2 ~ 5亿个十二指肠祖细胞。这样的细胞产量可能被认为足以输入急性或慢性疾病患者，但最终将需要数名供体为代谢疾病患者提供长期纠正。正如我们前面提到的，与任何其他祖细胞/干细胞来源共享的负担。值得注意的是，细胞输入不限于实体器官移植中常见的一或两种操作。与细胞输注(供体细胞被释放到靠近靶器官的循环激流中)相比，大的器官或组织的植入是一种侵入性操作，需要大量的手术。数十年的肝细胞移植已经明确证明，多种细胞输入不仅是可能的，而且是更好的选择。数十亿供者细胞可在数小时、数天、数周甚至数月时间内输入，以达到酶缺失的生理水平，并逆转先天性代谢缺陷。但与任何其他细胞疗法一样，需要遵守监管机构的规定，包括对每个受者的供者数量的限制。GMP指南已经发布，绝大多数现代细胞疗法(特别是同种异体疗法)需要满足这些标准，并响应特定的标准要求。肝细胞疗法(向受者输入同种异体祖细胞或干细胞)被归类为高级治疗药品(ATMP)。
结论和展望：
人类细胞作为一种创新性的医学治疗手段，可能为介入或再生医学，包括无法治疗的疾病提供前沿机遇。然而，这类产品需要响应严格而具体的施行要求。在已发表的报告中，细胞活力是输注前对细胞质量的唯一评价。细胞操作(即分离、选择或低温保存)后的细胞活力反映了细胞完整性和特性，但常规活力检测与肝脏代谢之间的相关性几乎为零。肝脏成熟和代谢是评估肝脏治疗的关键参数。在过去的几年中，已经制定和优化了释放标准和功能测试，以在患者输注前特异性地评估供肝或祖细胞。因此，细胞制品可以经过鉴定，并根据受者的需求进行定制。祖细胞和干细胞并不代表例外，它们要达到完全成熟并被识别为新的治疗方法，需要进行体外和体内验证。我们非常期待观察由十二指肠黏膜下腺体产生的肝祖细胞的新来源的进展。这些祖细胞和其他干性来源可能在纠正性细胞疗法中占据一席之地，或者代表支持更常规治疗的辅助产品。在医学界，我们都在进行完整和严格的验证分析后考虑可以给临床实践带来类似的新机会。
原文链接：
https://www.journal-of-hepatology.eu/article/S0168-8278(22)03154-3/fulltext
参考文献：
[1] Roberto Gramignoli. New Cell-based Approaches for Liver Disorders: from Experimental to Validated Clinical Treatment. October 28, 2022 https://doi.org/10.1016/j.jhep.2022.10.017
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