导读：
凋亡癌细胞与肿瘤微环境的相互作用调节了肿瘤的进展和转移。癌症相关成纤维细胞(CAFs)通过旁分泌交流在促进这些事件中起着至关重要的作用。在本文中，作者证明了暴露于凋亡癌细胞的肺CAFs的条件培养基(CM)抑制了TGF-β1诱导的癌细胞和CAFs的迁移和侵袭。直接暴露于凋亡344SQ细胞(ApoSQ)可以抑制CAF的迁移和侵袭以及CAF激活标记物的表达。暴露于ApoSQ的CAFs增强Wnt诱导信号蛋白1 (WISP-1)的分泌是这些抗迁移和抗侵袭作用的必要条件。药理抑制Notch1激活或siRNA介导的Notch1沉默可阻止CAFs产生WISP-1，逆转其抗迁移和抗侵袭作用。紫外线照射凋亡肺癌细胞表面Notch配体delta样蛋白1的表达增强触发Notch1-WISP-1信号通路。磷脂酰丝氨酸受体脑特异性血管生成抑制因子1 (BAI1)-Rac1信号通路促进CAFs胞浆化，并与Notch1信号通路相互作用促进WISP-1的产生。此外，单次注射ApooSQ可通过Notch1信号通路增强WISP-1的产生，抑制分离的Thy1+ CAFs中CAF活化标志物的表达，并抑制同系免疫正常小鼠的肺转移。来自暴露于ApooSQ的CAFs的CM治疗抑制了肿瘤生长和肺转移，而来自暴露于ApooSQ的CAFs的WISP-1免疫敲除CM治疗逆转了抗肿瘤和抗转移作用。因此，从暴露于凋亡肺癌细胞的CAFs中提取CM治疗可以抑制CAF的激活，从而阻止癌症的进展和转移。
简介：
2022年10月14日，来自韩国梨花女子大学医学院炎症-癌症微环境研究中心的Jihee Lee Kang教授课题组在Cell Mol Immunol（一区）杂志上发表题为“Reprogramming of cancer-associated fibroblasts by apoptotic cancer cells inhibits lung metastasis via Notch1-WISP-1 signaling”的文章[1]。作者提出，紫外线照射的凋亡肺癌细胞在CAFs中触发Notch1-WISP-1信号通路，从而阻止癌细胞和CAFs的迁移和侵袭。
主要结果：
来自于凋亡癌细胞的CAFs的CM抑制癌细胞的迁移和侵袭。
CAFs与癌细胞之间的旁分泌交流有助于癌细胞的迁移和侵袭。因此，作者首先研究了CAFs暴露于紫外线照射的凋亡癌细胞下是否通过分泌生物活性介质抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。ApoSQ处理CAFS 20 h。将含有ApooSQ的CAFs细胞(ApooSQ-CAF CM)和含有或不含TGF-β1的坏死细胞(NecSQ-CAF CM)分别与344SQ细胞共培养48 h，采用Transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。作者发现，ApoSQ-CAF CM阻止了TGF-β1诱导的癌细胞迁移和侵袭，而对照组(CAF CM)或NecSQ-CAF CM没有。用人非小细胞肺癌A549和结肠癌HCT116细胞系证实了CM对暴露于不同类型凋亡癌细胞的CAFs的抗迁移和抗侵袭作用。值得注意的是，无论是直接暴露于ApooSQ还是NecSQ都不能影响344SQ细胞的迁移和侵袭。另外发现，在344SQ细胞中，ApoSQ-CAF CM阻断了TGF-β1信号传导，包括通过Smad2/3、ERK、Src、p38 MAP激酶、FAK和Akt通路的信号传导(图1g)。ApoSQ-CAF CM还在mRNA和蛋白水平上逆转了TGF-β1信号诱导的MMP-2和MMP-12表达上调(图1h, i)。综上，这些数据表明，来自暴露于凋亡癌细胞的CAFs的CM通过抑制TGF-β1信号相关通路以及MMP-2和MMP-12的表达来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭。
图1：凋亡肺癌细胞诱导的CAFs CM抑制TGF-β1信号通路，抑制肺癌细胞的迁移和侵袭
WISP-1的分泌是观察到的抗迁移和抗侵袭作用所必需的。
为了确定CAFs分泌的旁分泌/自分泌因子是否对抑制迁移和侵袭至关重要，作者进行了细胞因子阵列分析，以确定单个样本中多达111种细胞因子的水平。ApoSQ-CAF CM中WISP-1、白血病抑制因子(LIF)、增殖素、肝细胞生长因子、趋化因子配体11 (CCL11)、血管内皮生长因子(VEGF)、正五聚蛋白3 (pentraxin 3)和CCL2 8种细胞因子水平较CAF CM和ApoSQ CM升高。在这些细胞因子中，WISP-1和LIF是增加最多的(图2a, b)。另一方面，其他细胞因子的水平，包括白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)，CD14，凝血因子III和骨桥蛋白，在ApoSQ-CAF CM中与CAF CM相比增加，但与ApoSQ CM相似或低于ApoSQ CM。因此，这些细胞因子也被排除在进一步研究之外。最后，使用针对WISP-1和LIF的特异性sirna确定了哪种细胞因子抑制迁移和侵袭。WISP-1敲低减少了CAFs的WISP-1分泌(图2c, d)，并逆转了ApoSQ- caf CM和ApoSQ对344SQ细胞(图2e, f)和CAFs的抗迁移和抗侵袭作用。相反，敲低LIF减少了ApoSQ诱导的CAFs的LIF分泌，但不影响WISP-1的分泌()，并没有影响344SQ细胞或CAFs的迁移和侵袭。
图2：WISP-1是抗迁移和抗侵袭作用所必需的
凋亡的癌细胞触发Notch1信号通路来产生WISP-1。
Notch1-WISP-1轴控制间质成纤维细胞在黑色素瘤侵袭和转移中的调控作用。因此，作者假设ApoSQ诱导的Notch1-WISP-1信号通路在肺癌细胞和CAFs的抗迁移和抗侵袭中起着至关重要的作用。为了验证这一假设，作者首先研究了ApoSQ刺激是否激活了CAFs中的Notch1信号通路。Western blot分析显示，ApooSQ增强了Notch信号通路下游靶蛋白Hes1和WISP-1的表达，而NICD1仅在激活Notch1通路时释放;此外，它还增加了WISP-1的分泌(图3a, b)。Hes1和WISP-1的mRNA表达水平在暴露于ApooSQ后也增加了，而NecSQ暴露没有这样的影响(图3c, d)。与这一发现一致的是，暴露于ApoSQ长达20小时增加了Notchresponsive报告基因4 × CSL-Luc的活性，而这种活性没有被NecSQ暴露所诱导(图3e)。此外，免疫细胞化学分析显示，在暴露于ApooSQ的CAFs中，NICD1和WISP-1染色增强(图3f)， WISP-1染色与NICD1染色共定位于细胞核。
图3：凋亡的肺癌细胞通过增强Dll1的表达触发Notch1信号通路，从而在CAFs中产生WISP-1
体内注射ApooSQ可通过Notch1信号通路增强WISP-1的产生，抑制CAF活化和肺转移。
为了证实Notch1-WISP-1信号通路在体内CAF激活和肿瘤进展中的抑制作用，作者从注射ApoSQ的前一天开始口服notch1 -选择性抑制剂LY3039478 (8 mg/kg)，每周3次，共6周(图4a)。LY3039478对小鼠体重、原发肿瘤重量和原发肿瘤体积无明显影响。然而，LY3039478逆转了ApoSQ诱导的肺表面肿瘤结节数量和转移率的降低(图4b-d)。LY3039478还逆转了Thy1+ CAFs中ApoSQ诱导的CAF标志物、MMPs、生长因子和趋化因子mRNA表达水平的降低，以及Notch1和Notch下游靶基因mRNA表达水平的升高(图4e)。此外，对原发肿瘤组织的连续切片进行的免疫组化分析表明，LY3039478逆转了Thy1+ CAFs中α-SMA表达的减少，并增加了NICD1和WISP-1表达。
图4：Notch1信号依赖的凋亡肺癌细胞注射对小鼠CAF激活和转移的抑制作用
ApoSQ-CAF CM在体内可抑制肿瘤进展和肺转移。
为了研究ApooSQ-CAF CM对肿瘤进展和肺转移的影响，我们在肿瘤内注射344SQ细胞后2天开始注射CAF CM或ApooSQ-CAF CM，每周3次。与CAF CM组相比，ApoSQ-CAF CM组原发肿瘤重量和体积均明显减小。与单次注射ApoSQ相似，注射ApoSQ-CAF CM可减少肺表面肿瘤结节数量和转移率。
为了证实WISP-1在ApoSQ-CAF CM体内抗肿瘤进展和抗转移效应中的关键作用，作者在CM中加入了抗WISP-1中和抗体或IgG同型对照2小时，然后将其注射到小鼠体内。注射WISP-1免疫敲除的ApoSQ-CAF CM后，肿瘤重量、肿瘤体积、结节数量和转移率无明显变化，而注射IgG同型对照的ApoSQ-CAF CM后，肿瘤重量、肿瘤体积、结节数量和转移率与注射WISP-1免疫敲除的ApoSQ-CAF CM相似。与我们的体外实验结果一致，注射ApoSQ-CAF CM可以抑制CD326+肿瘤细胞和Thy1+ CAFs的迁移和侵袭，而注射WISP-1免疫敲除的ApoSQ-CAF CM没有抑制作用。
此外，为了进一步证实WISP-1的抗肿瘤进展和抗转移作用，在344SQ细胞注射后2天开始，作者将rWISP-1(12.5和25 μg/kg)每周3次注射到同系小鼠的肿瘤内(图5a)。与ApoSQ-CAF CM注射的抑制作用相似，注射rWISP-1与对照组相比，原发肿瘤重量和体积减小，肺表面肿瘤结节数量减少，转移率降低(图5b-h)。rWISP-1抑制CD326+肿瘤细胞和Thy1+ CAFs的迁移和侵袭。
图5：重组WISP-1抑制小鼠肿瘤生长和肺转移
结论和展望：
作者提出，紫外线照射的凋亡肺癌细胞在CAFs中触发Notch1-WISP-1信号通路，从而阻止癌细胞和CAFs的迁移和侵袭。BAI1/Rac1和Notch1信号通路参与正向交互作用，维持CAF的最佳胞浆能力和WISP-1的同时产生。与此一致的是，体内数据表明，单次注射ApooSQ靶向CAFs并增强Notch1-WISP-1信号通路，导致侵袭性较低的CAF表型和减少肺转移。此外，ApoSQ-CAF CM或rWIPS-1可抑制肿瘤生长、肿瘤细胞和CAFs的迁移和侵袭以及转移的发生。这些数据证实了我们的假设，即ApoSQ-CAF CM的抗肿瘤效应是由WISP-1强介导的。因此，针对CAFs的凋亡癌细胞疗法或无细胞疗法，如使用暴露于凋亡癌细胞和CM成分(如WISP-1)的CAFs进行CM治疗，可能是抑制肺癌进展和转移的有效治疗方法。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41423-022-00930-w
参考文献：
[1] Kim HJ, Yang K, Kim K, Lee YJ, Lee S, Ahn SY, Ahn YH, Kang JL. Reprogramming of cancer-associated fibroblasts by apoptotic cancer cells inhibits lung metastasis via Notch1-WISP-1 signaling. Cell Mol Immunol. 2022 Oct 14. doi: 10.1038/s41423-022-00930-w. Epub ahead of print. PMID: 36241874.
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