原文题目：Comprehensive single-cell transcriptional profiling defines shared and unique epithelial injury responses during kidney fibrosis
通讯作者：Benjamin D. Humphreys
隶属单位：美国圣路易斯华盛顿大学医学系肾脏病学系
DOI：10.1016/j.cmet.2022.09.026
慢性肾脏病（CKD）影响全球约10%的人口，最终可导致肾衰竭。由于无法治愈，并且减缓进展的疗法相对较少，CKD患者患上了相当大的发病率和死亡率。在所有CKD中，无论潜在原因如何，失调的上皮代谢越来越被认为是驱动间质纤维化。了解驱动肾纤维化的最早细胞事件将提高我们对CKD病理生理学的了解，并可能确定新的，有效的治疗靶点。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）允许对细胞转录组学进行无偏倚的表征，并已广泛应用于破译细胞命运动力学和代谢异质性。最常用的scRNA-seq平台基于液滴微流体，但由于一些技术限制，包括通量低，难以分析多个样品或时间点，批次效应以及与固定样品不相容，许多研究分析有限数量的样品，仅提供特定生物学条件的“快照”。以前的工作已经表征了CKD和肾纤维化在单细胞分辨率，但这些研究通常缺乏多个时间点，特别是在早期阶段。即使存在样本多路复用方法，这种方法不容易扩大规模，由于在损伤和纤维化进展。例如，近端小管（PT）细胞占总肾细胞数的∼50%，因此罕见的细胞类型和状态在较低复杂性的scRNA-seq数据集中可能代表性不足。虽然多个scRNA-seq实验和大规模数据整合可以解决这些限制，但需要批量效应校正。
图1：用sci-RNA-seq3分析的小鼠肾脏纤维化的单细胞转录组学景观
在这里，我们优化了单细胞组合索引RNA-seq（科学-RNA-seq）以破译驱动肾纤维化的分子事件。我们利用sci-RNA-seq的高通量、高样品复用能力和低成本来表征两种小鼠模型的肾损伤和纤维化，单侧缺血再灌注损伤（uni-IRI）和单侧输尿管梗阻（UUO）。sci-RNA-seq与组织固定兼容，可在组织收集后立即稳定RNA，防止降解，允许多位点样品采集，并有助于在处理前从多个时间点存储样品。我们从11个生物学条件和24个样本的单一实验中生成了肾纤维化图谱。这种方法可以消除批次效应并分析309，666个细胞。我们报道，uni-IRI和UO在损伤后诱导了两种不同的PT细胞状态，具有独特的转录组学特征和命运结果。对这两种细胞状态的进一步研究突出了它们独特的代谢调节机制，包括在单IRI的最早阶段激活脂质代谢，其中我们鉴定了PLIN2 +脂质液滴。此外，我们描述了对肾单位节段损伤和修复的共享和独特的上皮反应，以及肾纤维化期间的肾基质异质性和细胞间通讯动力学。这种肾纤维化图谱是一种独特的资源，揭示了以前未被欣赏的上皮细胞状态。
图2：受伤近端小管的不同细胞状态
我们的数据集已存入在线交互式scRNA-seq数据分析器，使研究人员能够可视化不同细胞类型或疾病组中任何目的基因的表达。我们专门分析了uni-IRI和UOO的样本，这是两个表征良好的肾损伤和纤维化模型，并提出了一个计算工作流程（STAR方法），用于将我们的数据集与其他scRNA-seq图谱集成，因此可以在删除批量效应的情况下进行比较和联合分析。例如，我们将先前的scRNA-seq数据集整合到双IRI小鼠肾脏上，并发现所有主要的细胞状态都可以在两个模型中识别。
我们的 scRNA-seq 文库是使用 sci-RNA-seq3 方案生成的，这是一种基于 sci 的技术（也称为分裂池条形码）。sci-RNA-seq3与广泛采用的液滴微流体溶液（如10X铬）不同，它用几个条形码（而不是一个条形码）的独特组合标记每个细胞。尽管仍处于早期开发阶段，但基于sci的方法近年来由于其高通量能力，样品多路复用能力和对常见实验室设备。在这里，我们证明了其在从疾病模型中收集的固体组织的适用性。高通量和高度多路复用的数据集能够在疾病进展的过程中识别稀有细胞类型，例如此处描述的Type1 / 2损伤PT细胞。基于科学的方法还为构建全面的人类细胞图谱提供了一种经济高效的解决方案，通过并行分析多个样品以最大限度地减少批次效应，并且最近进行了改进以实现更高的基因检测灵敏度和多种模式的共同测量。
图3：纤维化过程中近端小管细胞脂质代谢失调和短期脂质沉积后激活脂肪酸氧化
我们的结果已经通过重新分析相关疾病模型上的现有小鼠和人类数据集得到了全面的验证。例如，我们在叶酸诱导的小鼠肾病模型。我们对2型损伤PT细胞的表征得到了先前数据集的支持，该数据集分析了UUO小鼠并验证了与对照组相比，CKD患者中2型（但不是1型）受损PT标记基因的表达增加。一个有趣且悬而未决的问题是，在人类肾脏疾病的早期阶段，任何一种受伤PT状态的丰度是否与长期患者预后相关。
PT细胞具有高基线能量需求，并优先利用脂质来产生ATP。PT中脂质的积累取决于血清FFAs的摄取和脂质代谢缺陷是CKD。最近的一项研究表明，长期脂肪酸摄取（10天棕榈酸给药）促进小鼠PT细胞的炎症和纤维化。在这里，我们确定了1型损伤PT细胞中一种意想不到的瞬时脂质积累和FAO相关基因表达增强。三项实验观察得出的结论是，FAO基因表达的增加有助于FAO表型的增加：（1）细胞在uni-IRI D2下具有非常低含量的细胞内脂质，这意味着在第二天利用了前6 h沉积的脂质;（2）脂质积累的体外建模，结合脂解抑制剂的使用表明，脂质液滴的清除是通过FAO;（3）直接代谢测定确定6小时脂肪酸处理后OCR增加。有趣的是，在我们对6小时油酸处理后2天收获的细胞进行大量RNA-seq分析中，我们发现参与DNA复制，细胞周期调节和细胞增殖的基因上调，这是高能量需求的细胞事件。这也符合我们的观察，即表达Mki67的PT-R细胞在单IRI D2下最丰富。因此，在6小时内沉积的脂质可以作为损伤后受伤上皮的必需能量来源，通过增殖扩张促进肾小管修复。
图4：PLIN2标记1型损伤近端小管中的脂质液滴并维持细胞能量状态
脂质液滴，也称为脂质液泡，是其磷脂单层装饰有脂质结合蛋白的细胞器，并含有由中性脂质组成的疏水核心。在这里，我们发现在体外进行6小时脂肪酸刺激后PLIN2表达增加∼10倍，在从培养基中去除脂肪酸2天后表达消退，这意味着PLIN2在细胞对细胞内脂质积累的反应中起着关键作用。此外，PLIN2基因敲低导致OCR和ECAR活性降低，表明PLIN2调节细胞代谢。虽然OCR降低可能有望反映粮农组织基因的下调，但我们没有发现编码线粒体粮农组织成分（如CPT1A和CPT2）的基因表达减少。相反，我们观察到ACSL3，ACSL4和ACSL5的表达显著降低，ACSL4和ACSL5编码细胞质蛋白，将脂肪分解衍生的FFA转化为脂肪酰基辅酶A。这些结果表明，PLIN2通过脂解调节酰基辅酶A的产生，但不直接影响线粒体β氧化。总体而言，我们提出了图4K中提出的模型：在IRI之后，1型受伤的PT细胞迅速积累脂质液滴，诱导PLIN2表达，导致PLIN2依赖性FAO活性增强，随后消耗这些脂质，促进上皮增殖和小管再生。为什么这种脂质积累和消耗过程不会发生在2型损伤PT（或UUO中），以及早期缺乏脂质获取是否是肾脏纤维化命运结果不佳的原因，需要进一步研究。
我们强调了患病PT细胞中两种失调的途径，脂质和氨基酸代谢，但我们也承认肾脏纤维化会影响许多其他代谢网络。例如，SLC5A2（SGLT2抑制剂的靶标）负责约90%的肾小管葡萄糖转运。由于单I-IRI和UUO中的细胞去分化，我们观察到PT中Slc5a2的表达显着降低。我们还发现了编码磷酸肌酸激酶，葡萄糖-6-磷酸酶和异柠檬酸脱氢酶的基因表达减少，这些基因可以在uni-IRI的晚期恢复，但在UUO中保持在低水平，这表明肾脏纤维化中的葡萄糖代谢中断。此外，我们发现编码乳酸脱氢酶亚基的两个基因Ldha和Ldhb失调，其模式与最近的一份报告，表明乳酸盐和丙酮酸之间不平衡的相互转化。有趣的是，我们鉴定出编码血红素加氧酶-1（HO-1，葡萄糖代谢的基本调节剂）的Hmox1及其转录因子Nfe2l2作为早期IRI损伤（即uni-IRI 6小时）的两个上调标志物，分布在1型损伤和急性损伤PT细胞中。先前的研究表明，HO-1对肾损伤具有保护作用，并且在使用HO-1诱导剂。了解HO-1在疾病状态下维持肾脏葡萄糖代谢的特定作用需要进一步研究。
图5：2型损伤PT细胞中参与氨基酸代谢的基因失调
这个高通量数据集使我们能够发现所有主要TEC结构的共享损伤反应，包括PT，TAL，DCT和CNT。尽管在本次分析中，TAL-inj，DCT-inj和CNT-inj被描述为覆盖来自uni-IRI和UUO的损伤细胞的群体，但我们不能排除它们是由多种损伤状态组成的异质性群的可能性，如受伤PT的特征。例如，我们发现Gcnt2，其缺乏可导致小管上皮的异常形态，特别是在单 IRI 6 小时时，在 TAL-inj 中上调，但在 UUO 中未上调（图 S6F）。这种额外的子聚类分析需要更高的检测分辨率。
图6：肾小管上皮细胞的共有和独特损伤反应
这种肾纤维化的单细胞图谱也是研究其他非上皮细胞如基质细胞，免疫细胞和内皮细胞（EC）的纤维化反应的独特资源。我们对所有这些人群进行了子聚类分析，以说明数据集的复杂性。例如，我们鉴定出一组巨噬细胞（Mφ-2），其标志是溶菌酶基因Lyz2，Tgfbi和编码HSP的各种基因的表达升高。Mφ-2在单-IRI 6 h/D2时表现出高丰度，但在UUO中丰度较低。据报道，TGFBI+巨噬细胞可以捕获凋亡细胞并诱导纤维化反应，我们的结果表明，Mφ-2可能是启动对肾损伤免疫反应的基本人群。在EC的亚群中，我们发现EC（激活EC）的亚组表现出Rapgef5和Magi1的上调表达，这些基因参与异常血管生成和内皮活化，这种细胞类型很少在健康组织中观察到，但在疾病中可以迅速增殖，特别是在UUO D6（Mendeley Data）之后，在未来的研究中了解其谱系祖细胞和在肾纤维化中的功能重要性将是很有趣的。
总之，我们利用sci-RNA-seq3来生成肾纤维发生的高通量单细胞转录组学景观。PT细胞去分化是uni-IRI和UUO模型中的共同损伤反应，但每个模型中都存在独特的细胞状态，例如1型和2型损伤PT，其特征分别为脂质和氨基酸代谢失调。我们还确定了肾单位段上皮细胞中共享和独特的损伤和修复反应，并证明了肾基质细胞的异质性。由于肾纤维化影响几乎所有的肾细胞类型，包括上皮细胞、基质、内皮质和免疫系统，因此构建一个全面的细胞-细胞通讯网络用于转化研究至关重要。我们的工作强调了分析肾脏纤维化详细时间过程的效用，并验证了sci-RNA-seq3是一次分析多个样品的强大方法。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.09.026
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