作科所解析双功能锌指蛋白转录因子基因GmZFP7调控大豆异黄酮积累的分子机制

大豆是世界上重要的粮饲兼用作物，也是优质植物蛋白和油脂的重要来源。它不仅含有丰富的蛋白质和油脂，同时也富含异黄酮等生物活性成分。大豆异黄酮对乳腺癌、前列腺癌和结肠癌等具有预防和抑制功效，因此改良大豆品种异黄酮营养品质，对提升我国大豆产业综合竞争力，保障人民生命健康具有重要意义。大豆异黄酮为典型的数量性状，受多基因控制，其调控网络十分复杂。

近日，New Phytologist在线发表了来自中国农业科学院作物科学研究所孙君明创新研究组题为“The Dual-Function C2H2-Type Zinc-Finger Transcription Factor GmZFP7 Contributes to Isoflavone Accumulation in Soybean”的研究论文。该研究前期利用构建的大豆异黄酮含量显著不同重组自交系群体，结合SLAF-seq重测序技术，构建了大豆高密度连锁图谱（Li et al. 2014, BMC Genomic），结合多年多点的异黄酮表型数据，采用ICM mapping方法，在20号染色体精细定位到一个多年多点可稳定调控异黄酮积累的主效QTL位点qIF20-2，表型解释率20%左右，该连锁区间全长0.53cM，对应的物理图谱长度为243.72 kb（Pei et al. 2018, Crop J），包含28个候选基因，其中17个基因在双亲中存在非同义突变，经转录组表达分析发现有2个转录因子基因在双亲中存在显著差异，一个是MYB类转录因子基因存在一个非同义突变SNP位点，另一个是锌指蛋白类转录因子基因存在2个非同义突变SNP位点，经转基因和基因编辑鉴定，发现该锌指蛋白类转录因子基因GmZFP7与异黄酮积累显著相关。本研究为大豆异黄酮分子育种提供可靠分子证据。

图1. GmZFP7在发状根中表达水平和异黄酮含量变化

本研究首先针对前期定位到主效QTL位点qIF20-2（Pei et al. 2018，Crop J），发现了一个C2H2锌指蛋白类转录因子基因GmZFP7（Glyma.20G012700.1），该基因在高低异黄酮含量的双亲中存在2个氨基酸变异，一个是在第114个氨基酸位置存在His到Arg变异，另一个是在第227个氨基酸位置存在一个终止密码子突变。我们首先利用发状根转化方法，过表达该基因可使发状根中的异黄酮比对照提高1.15-3.79倍，而沉默该基因可使异黄酮含量降低到27%。经RT-PCR分析发现，该基因可以促进异黄酮合成过程中关键酶GmIFS2基因表达，而抑制黄烷酮合成路径中的GmF3H1基因的表达。双荧光酶互补实验进一步验证了过表达GmZFP7基因具有提高GmIFS2表达，同时抑制GmF3H1表达的双功能，同时还明确了GmZFP7与关键酶GmIFS2 和GmF3H1结合的启动子区域。EMSA实验同样证明了该基因可以与关键酶基因GmIFS2 和GmF3H1物理性结合。

图2. GmZFP7双荧光素互补试验和EMSA试验结果

为了进一步验证该基因功能，我们还采用子叶节转化方法，将该基因进行编辑敲除和过表达转化，在基因编辑植株的叶片和种子中，可显著降低该基因的表达水平和异黄酮含量，同时可降低异黄酮合成路径中的GmC4H、GmCHS7、GmCHS8、GmCHR1、GmCHR3和GmIFS2的表达量，而提高GmF3H1的表达量。相反在过表达植株叶片和种子中，可显著提高该基因表达水平和异黄酮含量，同时可提高GmC4H、Gm4CL、GmCHS7、GmCHS8、GmCHR1、GmCHR4 和GmIFS2表达量。代谢组分析表明，在检测的129种酚类代谢产物中，在基因转化和编辑种子中可检测到57种代谢产物，其中24种存在差异，特别是在异黄酮合成路径中的上游产物，如苯丙烷路径中的肉桂酸、七叶树素、异甘草酸和根皮苷，黄酮类路径中的大波斯菊甙、毛地黄黄酮、芹黄素，以及黄烷酮路径中的柚皮苷和柚皮素含量显著升高。而黄烷醇合成路径中的槲皮素和烟花甙含量显著降低，芦丁、异鼠李亭甙和野樱素含量显著提高。

图3. GmZFP7过表达和基因编辑转植株中表达水平和异黄酮含量变化

基于1557份大豆种质的单倍型分析发现，在GmZFP7基因的编码区存在5个SNP变异位点，并组合出8不同单倍型，关联分析发现不同单倍型间的异黄酮含量变化不大。而其启动子区域，基于41个SNP位点，鉴定出37个单倍型，其中16个单倍型仅出现在野生种质中，而在栽培大豆中检测到10个单倍型，鉴定出两个优异单倍型P-Hap_1和P-Hap_3的异黄酮含量显著高于其他单倍型。

图4. GmZFP7的单倍型分析

总之，该研究首次解析了一个具有双功能的C2H2型锌指蛋白类转录因子基因调控异黄酮积累的分子机制，通过上调异黄酮合成路径GmC4H、Gm4CL、GmCHS、GmCHR和GmIFS2关键酶基因表达水平，抑制黄烷醇合成路径中关键酶GmF3H1的表达水平来提高异黄酮含量，这为大豆异黄酮的分子育种提供了新思路和优异基因，可加速大豆异黄酮育种进程。

图5. GmZFP7调控大豆异黄酮积累机制的示意图

作科所孙君明研究员和李斌副研究员为共同通讯作者。作科所博士研究生冯岳、作科所张晟瑞博士和李静博士为共同第一作者，该研究获得国家自然科学基金、重点研发计划、转基因重大专项和中国农业科学院创新工程项目资助。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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