国际植物学期刊Journal of Experimental Botany发表了中国农业大学王忆/韩振海团队的最新相关研究成果，题为MdNRT2.4 interacts with rhizosphere bacteria to enhance nitrate uptake in apple rootstocks的研究论文。
摘要
植物已经发展出复杂的机制来适应不断变化的硝酸盐(NO3-)水平，并可以招募微生物来促进氮的吸收。然而，关于苹果砧木吸收NO3-的功能基因与根际微生物群落之间的关系却知之甚少。
我们发现MdNRT2.4表达的差异导致了两个苹果砧木对硝酸盐的吸收差异。MdNRT2.4在苹果幼苗中的过表达通过增加根表面净NO3-内流，显著提高了苹果幼苗对低氮的耐受性。但当抑制根质膜H+-ATPase活性时，抑制了NO3-的吸收和释放，表明MdNRT2.4编码一种+偶联的硝酸盐转运蛋白。令人惊讶的是，在未灭菌的低氮土壤中，高表达MdNRT2.4的苹果幼苗的氮浓度高于灭菌的低氮土壤。利用16S核糖体RNA基因图谱分析根际微生物区系，发现过量表达MdNRT2.4的苹果幼苗招募了更多具有氮代谢功能的细菌类群，尤其是根瘤科。从苹果根际土壤中分离到一株细菌AR11，经鉴定为根瘤菌。与未接种相比，接种ARR11促进了低氮土壤上苹果幼苗的生长。
我们的结果强调了寄主植物基因与根际微生物群对寄主植物养分吸收的相互作用。
前言
硝酸盐(NO3-)是大多数陆地植物无机氮的主要来源，并作为信号分子发挥作用。苹果是世界上最重要的水果之一，在中国得到了广泛的栽培。然而，中国的大多数苹果园位于土壤条件差、NO3-有效性低的地区，这是苹果生产的一个主要限制因素。大多数关于苹果氮素利用和硝酸盐转运蛋白的研究主要集中在MdNRT2成员上，据报道，MdNRT2成员在促进低氮条件下NO3-的吸收方面发挥了重要作用。
在这里，我们研究了PM H+-ATPase和MdNRT2.4在NO3-摄取中的关系。我们比较了在不同NO3-浓度下两个氮素吸收不同的苹果砧木湖北海棠幼苗对NRT基因的反应和转录水平(MH和Malus sieversii Roem. Ms )。这两个砧木是中国本土的，广泛用于苹果生产。然后，我们利用高表达MdNRT2.4的转基因苹果幼苗，研究了该基因在低NO3-条件下的功能及其与质膜H+-ATPase活性的关系。
结果
1、水培苹果砧木植株生长及对NO3-的吸收
为了证实苹果对硝酸根吸收的差异，我们首先在不同浓度的硝酸根：正常浓度(NN，3.3 mMN NO3-)和低浓度(LN，0.3 mMN NO3-)的水培条件下，对两种不同的苹果砧木幼苗进行了30d的培养。
在LN条件下，Mh的新叶表现出显著更高的花青素积累；相比之下，MS的新叶轻微失绿(图1A)。在含有pH指示剂溴甲酚紫色的基质中，LN处理的苹果幼苗根际酸化程度显著高于NN处理，尤其是MS的根际酸化程度(图1B)。LN处理的MS根冠比显著高于NN处理，而Mh的根冠比差异不显著(图1C)。与NN处理相比，LN处理对Mh的NUPE没有影响，但在LN处理的Ms中显著增加(图1D)。这些结果表明，在LN下，两个砧木之间的NUPE存在显著差异，MS的NUPE显著大于Mh(图1D)。
从MS的根表面流入的NO3-是来自Mh的1.9-2.5倍(图1E)，这表明在LN条件下，苗木的根保持了NO3-的净吸收。
RNA-SEQ结果表明，LN处理下，NRT家族成员在苹果砧木根中的转录水平发生了变化，尤其是MdNRT2.4(图1G)。QRT-PCR检测表明，在LN处理组中，MdNRT2.4的表达随时间的延长而增加，在LN处理24小时后，MS组的MdNRT2.4表达的变化显著高于Mh组。
此外，在LN处理下，质膜H+-ATPase(HA)基因也发生了改变，尤其是MdHA2的表达与MdNRT2.4相似。
图1：不同硝酸盐处理对Mh和MS生理特性及基因表达的影响
因此，我们推测MdNRT2.4的表达可能与低NO3-供应条件下苹果砧木中的NUPE有关。
2、MdNRT2.4在缺氮条件下苹果根系NO3-吸收中的作用
在LN条件下培养30天后，转基因植株新叶表现出轻微的失绿；CK表现出显著的花青素积累(图2A)。与CK相比，MdNRT2.4-ox的叶片和根的总氮浓度分别高出14-27%和21-25%(图2B)。将植物暴露在低15N标记的NO3-水培溶液中，MdNRT2.4-ox植株的叶和根中15N的富集量高于对照植株(图2C)。
CK根对NO3-的净吸收很少，而MdNRT2.4-ox根保持净NO3-吸收(图2D)。这些结果证实了MdNRT2.4正向调节LN下根系对NO3-的吸收。
此外，与对照植物相比，MdNRT2.4-ox植株根尖的质外体pH显著降低，根表面的净+分泌量显著增加(图2E，F)。因此，我们推测PM H+-ATPase与MdNRT2.4协同作用，在低NO3-供应的情况下与NO3-的摄取密切相关。
图2：过表达MdNRT2.4增加了NO3-缺乏条件下苹果砧木对硝酸盐的吸收
3、PM H+-ATPase在低NO3-供应时驱动NO3-摄取
为了评价PM H+-ATPase对NO3-吸收的影响，我们将根暴露于500μM原钒酸(LN+VANA)以抑制PM H+-ATPase活性。
在LN+VANA条件下，抑制剂使PM H+-ATPase失活，导致根尖的根际和质外体pH显著增加，与LN处理相比，LN+VANA显著抑制了根部NO3- 浓度，说明质膜H+梯度对苹果砧木根系吸收NO3-有重要作用。
为了探索PM +ATPase是否与MdNRT2.4在根NO3吸收中的作用有关，我们在分根系统中种植了MdNRT2.4-ox植物，LN在一个隔室，LN+Vana在另一个隔室(图3D)。当MdNRT2.4-ox植株生长在分根系统中时，LN处理的根尖质外体仍然显著酸化，平均NO3-内流仍然保持(图3D，F)。相反，LN+Vana处理抑制了MdNRT2.4-ox根的酸化，导致净NO3从根表面强烈排出，显著降低了根NO3-浓度，但并没有减少MdNRT2.4的表达。这些结果证实了质膜H+-ATPase在根部NO3-吸收中起着关键作用，并影响了MdNRT2.4在根部NO3-吸收中的作用。
图3：PM H+-ATPase活性对NO3-缺乏下MdNRT2.4-ox和对照植物硝酸盐吸收的影响
4、MdNRT2.4影响苹果根际微生物区系以提高氮素利用率
我们发现，在水培LN条件下，MdNRT2.4在NO3吸收过程中起着关键作用。为了确定其在土壤中的作用，在相同的低氮条件下，将MdNRT2.4-ox和对照植物转移到灭菌和未灭菌的土壤中。
MdNRT2.4在土壤中具有类似的作用。MdNRT2.4-ox植物在未灭菌土壤中有更大的氮素吸收，而在灭菌土壤中显著降低氮素吸收。对照植物在灭菌和未灭菌的低氮土壤中没有表现出显著的氮浓度差异。
我们利用16SrRNA对根际微生物测序。在主坐标分析(PCoA)中，MdNRT2.4-ox和对照植物的根际微生物区系形成两个簇(图4B)。
我们发现，在水培LN条件下，MdNRT2.4在NO3-吸收过程中起着关键作用。为了确定其在土壤中的作用，在相同的低氮条件下，将MdNRT2.4-ox和对照植物转移到灭菌和未灭菌的土壤中。
此外，Lefse分析还鉴定了根瘤菌(OTU2638)是MdNRT2.4-ox中最重要的生物标记分类群(图4D)。冗余分析(RDA)表明，根瘤菌、化感根瘤菌和链霉菌的相对丰度与pH呈负相关，与根蔗糖含量呈正相关，pH是影响细菌群落的主要因素(图4E)。
在MdNRT2.4-ox根际最丰富的12种功能中，有8种与氮代谢有关(图4F)。这些结果表明，MdNRT2.4的高转录水平可能导致根际的弱酸化，从而招募特定的细菌来调节低氮土壤中氮素的生物有效性和吸收
图4：在贫氮土壤上，MdNRT2.4影响根际微生物群落和功能特征，促进苹果砧木的氮素利用
5、接种根瘤菌提高苹果氮素吸收
为了研究MdNRT2.4-ox植物中的富含的特异性OTU的功能(图4D)，我们从苹果砧木根际土壤中分离出细菌分离物。
我们发现ARR11具有几个促进植物生长的特性，如产生吲哚乙酸(258.26 μg ml-1)和固氮酶活性。我们将ARR11接种在无菌低氮土壤上生长的苹果砧木上，并评价其对砧木生长和氮素吸收的影响。4周后，未接种的对照植株表现出缺氮表型；相比之下，ARR11处理的植株表现出轻微的叶片黄化.接种ARR11的植株生物量显著增加(根、茎和叶分别比对照高12.6-36.1%、14.3-18.8%和11.9-22.6%)。同时，接种ARR11的植株的根和叶的氮浓度显著高于对照植株(图5C，D)。这些结果表明，根瘤菌属(Rhizobium sp.)ARR11可能通过生物固氮和促进根系生长来促进根系氮素吸收。
图5：在贫氮土壤条件下，固氮菌能促进苹果砧木的生长和氮素吸收
讨论
在这项研究中，我们使用了该地区常见的两个苹果砧木来探索氮素吸收机制，发现两个不同苹果砧木的NUPE存在显著差异，MS显示在LN处理中NUPE显著增加(图1D)，这表明具有较高氮素吸收能力的MS可能有助于嫁接接穗在低氮条件下的生长。
数据表明，MdNRT2.4是由低氮诱导的，并增强了砧木NUPE(图1D，H)。MdNRT2.4-ox根的NO3-内流速率高于对照根，导致氮素浓度增加，硝酸盐抗性较低(图2)。此外，PM H+-ATPase的活性作为驱动因素调节MdNRT2.4的功能(图3；图6)。中国大多数苹果园的土地条件很差，土壤氮素有效性往往很低。在天然缺氮土壤中，较高转录水平的MdNRT2.4可以招募更多的根瘤科微生物，这可能通过改善氮代谢和刺激根毛来促进苹果砧木的生长(图4；图5)。此外，我们可以调节植物基因和根际微生物群落之间的关系，以提高苹果的氮素吸收效率和可持续生产(图6)。
先前的研究表明，NRT2家族基因的表达，如PpNRT2.1在桃树中的表达，在短期低NO3-条件下被诱导，而在高NO3-浓度下受到抑制。在我们的实验中，LN显著诱导MdNRT2.4，尤其是在MS。在LN水培条件下，MdNRT2.4-ox植株比对照植株有更高的氮浓度和15N富集量。此外，MdNRT2.4的过表达提高了根中NO3-的净流入速率。对不同植物中NRT之间进化关系的分析表明，MdNRT2.4可能是AtNRT2.1和PpNRT2.1的同源基因，属于HATS，位于质膜上，表明MdNRT2.4在对缺氮的反应中发挥重要作用。
在自然生长条件下，植物与根际微生物群之间的协同作用对于植物养分的获取和生长至关重要。在本研究中，与灭菌的低氮土壤相比，MdNRT2.4-ox植株在未灭菌的低氮土壤上的根氮浓度显著增加，这在对照植物中没有观察到(图4A)。
此外，我们发现在未灭菌的低氮土壤中，MdNRT2.4-ox和对照植物根际微生物区系的多样性和组成存在差异。在我们之前的研究中，我们发现苹果砧木对氮素的低耐受性形成了它们的根际细菌群落，并且富集菌与总氮浓度显著正相关。同样，MdNRT2.4-ox植物的根际招募了更高比例的与氮代谢相关的细菌(图4F)。这些细菌促进了氮的转化过程，并提高了苹果砧木根际土壤中的全氮和速效氮，这可以解释为什么MdNRT2.4-ox植株的氮素浓度高于对照植株(图4A)。
本研究结果揭示了宿主植物基因与根际微生物群在宿主植物养分吸收方面的相互作用。
图6：MdNRT2.4和根际群落对氮素利用的调控模型，以及低氮条件下苹果砧木的功能特征
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