中国农大何绍贞/张欢团队揭示甘薯叶发育和类黄酮合成的分子机理

2022 年 11 月 15 日，Plant Physiology 在线发表了中国农业大学 何绍贞/张欢 团队题为 "B-box transcription factor IbBBX29 regulates leaf development and flavonoid biosynthesis in sweet potato" 的研究论文。

甘薯是一种重要的粮食作物，在全球排名第八，2020 年产量为 8949 万吨 (FAO, 2020) 。我国是世界上最大的甘薯生产国，由于甘薯对不同环境和土壤条件的适应性和复原力强，它在粮食安全方面发挥着重要作用。近年来，甘薯超高的营养价值被广泛关注，除了产量高、营养丰富的贮藏根，甘薯的茎尖也富含矿物质、蛋白质、膳食纤维、多酚、维生素和微量营养素等。薯尖是一种绿色健康蔬菜，越来越受到人们的喜爱。甘薯茎叶产量高、再生快、全年多次收获，可作为生物强化和工业提取营养物质的材料。避免资源浪费，甘薯茎叶的开发和利用是非常有必要的。甘薯茎叶发育和营养品质调控基因的挖掘和调控机理的研究对提升甘薯茎叶利用价值具有重要的意义。

甘薯类黄酮是一种天然抗氧化剂，具有抗炎、抗癌等生物活性，甘薯茎叶富含类黄酮，挖掘调控甘薯茎叶发育及类黄酮积累的关键调控因子，对开发利用甘薯产量巨大的地上部茎叶，开拓生物强化候选植物，提取天然抗氧化剂具有重要意义。

该团队研究发现，甘薯中一个 B-BOX 家族 IbBBX29 基因在叶片中表达水平很高，且被 IAA 显著诱导。过表达 IbBBX29 可使田间生长状态下甘薯叶片增大、加厚，茎增粗，致使地上部和叶片生物量分别增加 47.10% ~ 57.17% 和 21.37 ~ 70.94 %。与 WT 相比，过表达 IbBBX29 植株叶片的表皮细胞增大，栅栏组织和海绵组织较发达；叶片中的类黄酮积累量增加 31.33 ~ 63.03%，贮藏根中类黄酮积累量增加 36.59 ~ 92.39%，叶片抗氧化性提高。此外，IbBBX29 的过表达和沉默不影响甘薯贮藏根产量。在拟南芥中异源表达该基因能够使叶片中类黄酮含量增加 9.93%~24.51%，转基因植株形态也产生变化。

对转基因植株 (OE-5 和 Ri-2) 和 WT 植株叶片进行转录组测序分析，共鉴定到 443 个差异表达基因，主要富集在生长素响应、信号传导及转运和类黄酮生物合成等通路。值得注意的是，与细胞扩张相关的 DEGs 如 IbARGOS、 IbTOR、 IbEBP1、 IbZHD6 在 OE-5 中上调表达，而在 Ri-2 中下调表达。此外，与 WT 相比，参与生长素生物合成、运输和信号传导的调控基因在 OE-5 中上调表达，而 Ri-2 中下调表达。测定发现 IbBBX29 过表达甘薯和拟南芥植株叶片 IAA 含量均增加。一些类黄酮生物合成关键基因也在 OE-5 中上调表达，而在 Ri-2 中下调表达。

采用高效液相色谱-串联质谱法对转基因和 WT 植株叶片中黄酮类化合物进行了定量分析。结果表明，与野生型相比，16 种黄酮类化合物在在 OE-5 中含量提高，比如查尔酮 (根皮甙 phlorizin) 、黄酮 (白杨素 chrysin) 、黄酮醇 (阿福豆苷 afzelin) 、黄烷醇 (没食子酰儿茶素 (–) -gallocatechin) 、黄烷酮 (山姜素 alpinetin) 等，在 Ri-2 植株中含量降低。

BBX 蛋白通常结合在下游基因启动子上的 T/G-boxes 和 GT-1 顺式作用元件上 (Xu et al., 2018; Bai et al., 2019; Zhang et al., 2020, 2021) 。ChIP-qPCR、 EMSA 和荧光素酶报告实验验证 IbBBX29 选择性地结合在生长素信号通路中的基因 IbPIN1D、IbBIG 和 IbTIR1，以及类黄酮生物合成通路中的基因 IbCHS、 IbCHI1 和 IbF3′H 的启动子的 T/G-boxes 元件上，进而激活基因的表达。有意思的是，与转录起始位点 (TSS) 相邻的 T/G-box 结合位点比其他位置更容易被 IbBBX29 结合。

为了寻找 IbBBX29 的互作蛋白，我们利用 OE-5 和 WT 植株进行了免疫沉淀结合质谱分析实验 (IP-MS) 。共得到 73 个可能与 IbBBX29 互作的蛋白，它们参与调节叶片形态、苯丙氨酸生物合成、发育、IAA 信号传导等。进一步通过 Y2H、 BiFC、 LCI 及 co-IP 验证 IbBBX29 与 MADS 家族转录因子 IbAGL21 及苯丙氨酸合成蛋白 IbMYB308L 相互作用，共同调控甘薯叶片的发育与类黄酮合成。

综上所述，该研究在甘薯中发现 B-BOX 家族 IbBBX29 基因调控甘薯叶发育和类黄酮积累，为植物类黄酮生物强化提供了候选基因。

中国农业大学农学院甘薯生物学与生物技术重点实验室 何绍贞 教授为该论文通讯作者，在读博士 高晓茹 和 张欢 副教授为该论文的共同第一作者。刘庆昌 教授、翟红 教授、高少培 副教授对该工作进行了指导和帮助。江苏农业科学院 边小峰 研究员、张铅 博士，烟台农业科学院 贾礼聪 博士参与了该项工作。感谢 白一苇、彭葵、王祯、代卓儒 等同学在研究过程中的付出和帮助！

本研究得到了国家重点研发计划 (2019YFD1001301 / 2019YFD1001300)、三亚崖州湾科技城项目 (SCKJ-JYRC-2022-61 / SYND-2022-09)、北京自然科学基金 (6212017)、国家自然科学基金 (31771856 / 31901584)、北京市粮食作物创新联盟计划 (BAIC02 - 2022) 等项目的资助。

转自：“iPlants”微信公众号

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