外泌体是由细胞分泌的小型细胞外囊泡（sEV），直径约为30~100nm，可有效影响细胞间通讯。外泌体中包含“货物”的异质性是外泌体功能多样性的基础，而阐明不同“货物”分选到外泌体中的机制是理解外泌体异质性及其功能的关键，也是目前的研究热点之一。内体分选复合物（ESCRT）在外泌体的生物发生中起重要作用，HRS（肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物）是其关键组成成分。HRS介导初始“货物”的识别并分选成多泡内体（MVE），然后将其传递到质膜进行外泌体分泌，因此其在外泌体异质性中发挥关键的作用。有趣的是，不同内容物的外泌体在机体生命过程中可能发挥不同甚至相反的作用如肿瘤免疫，因此理解外泌体内容物异质性的机制可能为肿瘤免疫或治疗提供潜在的策略。
研究背景
Research Background
使用抗程序性死亡蛋白1（PD-1）抗体的免疫检查点阻断（ICB）方法已被证明在多种类型癌症的治疗中是有效的。然而，大多数癌症患者对ICB治疗都反应不佳。最近的研究表明，相比于肿瘤周围CD8+ T细胞数量多的患者来说，肿瘤内CD8+ T细胞数量多的患者对ICB的反应更好。因此，了解CD8+ T细胞浸润到肿瘤中的分子机制是提高肿瘤免疫治疗的关键所在。
据报道，肿瘤细胞能分泌携带PD-L1的外泌体，PD-L1是一种关键的免疫检查点蛋白，其可以阻断CD8+ T细胞的浸润。而肿瘤细胞调控PD-L1装载到外泌体中的机制目前尚不清楚，这也是此次推荐文献中作者想要研究的问题。
研究成果
Research results
2022年7月14日，宾夕法尼亚大学生物系的郭伟教授课题组在Nature communications（IF=17.694） 杂志上发表了题为“HRS phosphorylation drives immunosuppressive exosome secretion and restricts CD8 T-cell infiltration into tumors”的文章。该研究揭示了肿瘤细胞中磷酸化HRS通过诱导包含有PD-L1的免疫抑制型外泌体分泌调节肿瘤免疫的机制，并指出阻断HRS的磷酸化可以作为提高癌症免疫治疗效果的潜在靶点。
原文连接：doi.org/10.1038/s41467-022-31713-6
研究过程与结果
Research Process and Results
1.ERK磷酸化HRS并抑制CD8+ T细胞浸润到肿瘤中
癌细胞会分泌影响肿瘤微环境和免疫系统的外泌体，而HRS在外泌体的生物发生中发挥着重要的作用，因此作者首先对癌细胞中HRS的潜在磷酸化进行分析。通过质谱法作者分析了从转移性黑素瘤细胞系WM9中纯化的HRS，并鉴定了一种磷酸肽。该磷酸肽中中345号位点的丝氨酸（S345）被磷酸化（图1a），而S345与细胞外信号调节激酶（ERK）的作用位点相匹配。为了验证ERK在S345上对HRS的磷酸化，作者将丝氨酸残基突变成丙氨酸（S345A），该点突变消除了ERK对HRS的磷酸化。而同样作为ERK磷酸化识别位点的相邻苏氨酸残基（T347）突变（T347A）后则无法阻止HRS的磷酸化（图1b）。在体外水平上活化的ERK（CA-ERK）而不是失活的ERK（KD-ERK）能磷酸化HRS。同时，ERK激活剂表皮生长因子（EGF）处理能使HRS磷酸化，而ERK抑制剂SCH772984处理则会阻止HRS磷酸化（图1c-d）。
此外，在不同患者的原发性黑素瘤中观察到p-HRS水平高的肿瘤中CD8+ T细胞的浸润（TIL）减少，且TIL数量与p-HRS水平呈负相关而与总HRS水平没有相关性（图1e-i）。在单个肿瘤中，也发现p-HRS水平高的区域CD8+ T细胞浸润到肿瘤中的数量降低（图1j-l）。以上结果表明ERK引起HRSS345的磷酸化从而抑制黑色素瘤中CD8+ T细胞的浸润。
图1.ERK对HRS的磷酸化抑制了黑素瘤中CD8+ T细胞的浸润
2.HRS磷酸化诱导对抗PD-1治疗的耐药性
CD8+ T细胞浸润与抗肿瘤免疫有关，因此为了研究肿瘤细胞中HRS磷酸化是否参与免疫抑制，作者建立了野生型（HRSWT）、磷酸化缺乏型（HRSS345A）及磷酸化模拟突变型（HRSS345D）三种含有不同YUMMER1.7肿瘤细胞的小鼠。流式细胞分析表明，HRSS345D肿瘤中TIL的数量显著降低，且浸润的CD8+ T细胞中表达Ki-67及颗粒酶B阳性细胞的比例也降低（图2a-b）。
接下来，作者研究了表达不同HRS的肿瘤细胞对抗PD-1治疗的响应是否不同。相比于HRSWT 及HRSS345A小鼠，HRSS345D小鼠中肿瘤的生长并没有受到抗PD-1抗体的影响（图2c）。B16F10黑素瘤细胞对抗PD-1治疗不响应，作者通过抗PD-1抗体和ERK抑制剂BVD-523共同处理含有不同HRS的B16F10，在BVD-523抑制ERK使HRS无法磷酸化后HRSWT及HRSS345A 型B16F10的生长受到抗PD-1抗体的抑制作用，且CD8+ T细胞浸润增多，而在HRSS345D型B16F10中则不会出现这种现象（图2d-f）。以上结果表明HRS磷酸化抑制功能性CD8+ T细胞浸润，并促进肿瘤细胞对抗PD-1治疗的耐受性。
图2.HRS磷酸化降低小鼠抗PD-1治疗的效果
3.HRS磷酸化导致外泌体中PD-L1的选择性富集
鉴于HRS在外泌体的生物发生中发挥重要作用，作者检测了不同HRS黑素瘤细胞中外泌体（sEV）所含成分的差异。结果表明，相比于HRSWT及HRSS345A 型黑素瘤细胞PD-L1在HRSS345D 型黑素瘤细胞中的富集最为显著，而WB结果也验证了这一点（图3a-e）。同时，通过免疫荧光和免疫共沉淀实验，作者发现HRSS345D 型黑素瘤细胞中HRS和PD-L1发生了显著的共定位和相互作用（图3f-h）。
据报道，HRS不仅能通过泛素相互作用基序（UIM）与泛素化货物结合，还能与泛素非依赖性的货物结合。作者发现缺乏UIM的HRS仍能与PD-L1结合，但去除276到478位点的氨基酸残基后两者则无法发生互作（图3i-j）。鉴于S345位于PD-L1结合区域内，这暗示PD-L1是以泛素非依赖性方式与HRS结合的以及S345的磷酸化特异性调节泛素非依赖性分选。以上结果表明ERK引起HRS磷酸化从而与PD-L1互作，使PD-L1富集在外泌体中。
图3.HRS磷酸化选择性地将PD-L1富集在外泌体中
4.源自HRSS345D 型细胞的外泌体有效抑制CD8+ T细胞浸润
为了研究来自不同HRS突变类型细胞的sEV对肿瘤生长的影响，作者内源性地敲除了B16F10细胞的PD-L1，并用不同HRS突变类型细胞的sEV注射到小鼠体内。结果表明，HRSS345D 型细胞的sEV能显著促进小鼠的肿瘤生长，而在Rag2−/−免疫缺陷型小鼠中则没有出现这种现象（图4a-b）。同时，HRSS345D 型细胞的sEV也能显著抑制CD8+ T细胞浸润、降低浸润的CD8+ T细胞中Ki-67及颗粒酶B阳性细胞的比例、下调T细胞增殖活化相关蛋白的表达以及减弱T细胞对B16F10细胞的细胞毒性，并且其可能是通过与肿瘤细胞周围的ECM结合来阻止CD8+ T细胞浸润的（图4c-I）。
接下来，作者将HRSS345D 型B16F10细胞中的PD-L1敲除后或用抗PD-L1的抗体预处理后，其sEV对CD8+ T细胞浸润的抑制作用减弱，肿瘤的生长受到影响（图5a-e）。由于ERK抑制剂BVD-523可以阻断PD-L1在sEV上的聚集，作者研究了BVD-523是否可以调节sEV从而治疗肿瘤。经BVD-523处理细胞的sEVWT对T细胞激活、迁移和细胞毒性的抑制作用减弱，而sEVS345D则不会受到这种影响（图5f-g），在转移了CD8+ T细胞的Rag2−/−小鼠中BVD-523处理也具有同样的效果（图5h）。以上结果表明HRS的磷酸化调节PD-L1富集在外泌体中，含有PD-L1的外泌体与肿瘤细胞周围的细胞外基质结合从而阻滞CD8+ T细胞浸润达到免疫抑制的效果。
图4.HRS磷酸化细胞的sEV对CD8+ T细胞的抑制作用
图5.HRS磷酸化介导富含PD-L1的外泌体抑制CD8+ T细胞
研究总结
Research results
在本研究中，作者指出与外泌体发生相关的HRS能响应致癌信号在S345位点上发生磷酸化。p-HRS通过介导PD-L1富集在外泌体中并分泌到胞外与肿瘤细胞周围的细胞外基质结合，从而阻断CD8+ T细胞的浸润，达到免疫抑制的效果。该研究发现抑制HRS在S345位点上的磷酸化能使肿瘤对抗PD-1治疗敏感，这提供了靶向HRSS345D的小分子抑制剂治疗癌症的可能性，为ICB疗法的改善提供了关键的思路。
转自：“学术查”微信公众号
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