结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症死亡原因。在各种致病因素中，环境风险因素是导致结直肠癌发生发展最直接的贡献者。而在环境因素中，肠道微生物是影响肿瘤发生发展的关键因素，其部分方式是通过调节免疫系统和产生微生物代谢物。并且炎症性肠病患者相比较于正常人来说更易受到肠道菌群的致癌影响。今天给大家带来的这篇Science文章鉴定出了一种新的肠道菌群衍生出的基因毒素，并揭示了它们对宿主肠道生理和肿瘤风险的潜在影响，为CRC的预防和干预带来了新的思路。
2022年10月28日，耶鲁大学的Noah Palm团队在Science（IF:63.832）上发表题为“Commensal microbiota from patients with inflammatory bowel disease produce genotoxic metabolites”的文章。该研究通过建立一套基于凝胶电泳的体外筛选方法，对CRC风险升高的炎症性肠病（IBD）患者的肠道菌群进行了系统性分析，鉴定出122个产生基因毒素的菌株。基于此，研究团队发现了一个摩氏摩根氏菌（M. morganii）衍生先前从未被鉴定出的小分子基因毒素家族，称为indolimines，在基于细胞和非细胞的检测中均引起DNA损伤。进一步研究发现了一种以前未被鉴定的细菌脱羧酶(一种由aat基因编码的天冬氨酸氨基转移酶)，它对indolimines合成至关重要。
原文链接：https://doi.org/10.1126/science.abm3233
背景介绍
肠道菌群中的一些促癌细菌可通过产生基因毒素（genotoxins），引起宿主细胞DNA损伤和基因突变，促进结直肠癌（CRC）的发生发展。其中研究较多的是某些大肠杆菌能产生大肠杆菌素，这种小分子基因毒素可通过与DNA交联引起DNA双链断裂来加剧肠癌的发生发展。此外，人类肠癌也含有和大肠杆菌素相关的基因突变。然而，除此以外，人们对其他促癌细菌衍生的基因毒素所知甚少。本文通过建立的毒性菌群体外筛选方法研究出先前一种从未被鉴定出的细菌毒性代谢物，这个开创性的研究思路和研究手段对未来肠道菌群的研究无疑是一笔宝贵的财富。
主要结果
1、建立从炎症性肠病患者中鉴定基因毒性肠道微生物的管道
为了评估并筛选出具有基因毒性的菌株，作者建立了一套基于凝胶电泳的体外筛选方法，这套筛选模式的基本工作原理如下：由于大肠杆菌素等基因毒性代谢物可能难以分离，作者的主要研究集中在单个细菌分离物与线性化pUC19质粒DNA的共孵育(图1A)。该实验的原理是，在原生和变性条件下，通过电泳可以评估DNA损伤的程度和模式:在原生电泳条件下，双链线性化pUC19 DNA作为一个缓慢移动的条带迁移，而变性处理将双链DNA分离为单链DNA，形成一个迁移率更高的条带(图1A, L2)。DNA链间交联的形成，例如在大肠杆菌素的作用下，在变性条件下也不会展开，从而产生与双链DNA具有相同迁移率的条带(图1A, L3)。已知DNA中许多位点的烷基化会降低糖苷键的稳定性，导致去糖基化和碎片化。经过电泳，这些受损的DNA产物被检测为更小的迁移率更高的片段(图1A, L4)。即使在原生条件下， DNA酶介导的降解也会导致DNA丢失(图1A，图L4)。最后，由限制性内切酶类分子诱导的DNA损伤在原生条件下会产生多个条带，在变性条件下与烷基化或DNA类分子诱导的损伤结合后会产生更小的片段(图1A、L5)。
基于此筛选方法，作者系统性地评估了来自IBD患者的122株细菌的基因毒性，筛选出了18个具有很强的基因毒性的菌株，进一步发现这些菌株的上清液也具有很强的基因毒性，且对DNA损伤与大肠杆菌素作用的机制不同。
图1（A）肠道微生物直接基因毒性功能筛选概述：来自11名IBD患者的122株系统发育多样性细菌分离株(基于门的阴影:红色，放线菌门;蓝色，拟杆菌门;绿色，厚壁菌门;灰色，梭杆菌门;通过与质粒DNA共孵育，然后进行凝胶电泳，评估其基因毒性。通过OD600确定所有菌株的细菌生长曲线，并在指定的条件下(TE，指数相时间点;TS固定相时间点)。对纯化的质粒DNA进行原生或变性处理后，用凝胶电泳评估DNA损伤。
2、IBD患者的肠道微生物摩氏摩根氏菌会产生小分子代谢物，诱导DNA损伤
为了确定上述通过电泳筛选鉴定的18种推定的基因毒性细菌分离株是否产生基因毒性小分子，导致肠道细胞DNA损伤，作者将其上清(SUP)分离为小分子量和大分子量组分(分别为＜3 kDa SUP和＞3 kDa SUP)，并使用HeLa细胞评估这些组分的遗传毒性。作者发现大多数菌群的小分子代谢物都能诱导DNA损伤标志物γ-H2AX表达的增加。根据不影响细胞存活的要求并结合碱性彗星展开实验，发现摩氏摩根氏菌（M.morganii）在IBD和CRC患者中都会高表达并且其基因毒性主要是其小分子代谢物。进一步研究发现，摩氏摩根氏菌代谢物的产生并不同于大肠杆菌素产生方式。
图2.(A)不同处理下HeLa细胞的几何平均荧光强度(MFI)和γ-H2AX染色代表性直方图。(B)碘化丙啶(PI)染色评价细胞周期阻滞的代表性数据
3、摩根分枝杆菌基因毒素的分离与鉴定及其合成途径研究
为了识别摩根分枝杆菌产生的特定基因毒素，作者采用基于超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱(UPLCQTOF-MS)的非靶向代谢组学和小规模培养的生物活性指导分馏，然后进行大规模培养和分离，以进行明确的结构阐明基因毒性分析（图A）。经过大规模培养和乙酸乙酯萃取高效液相过柱以及不断剔除鉴定后得到了四个组分（图D,G），其中F2组分表现出很强的基因毒性。经过进一步的核磁共振波谱分析，作者确定了F2组分中的两种代谢物（化合物I：indolimine-214和化合物II,图D）。随着进一步发现，摩根分枝杆菌的基因毒性主要是由indolimine-214导致的，化合物II更多的作用是化合物I的辅佐剂。
图3.(A)摩根分枝杆菌基因毒素的分离与鉴定流程示意图。（D,G）化合物indolimine-214的化学结构。
接着，根据indolimines的结构，作者猜想了其可能的合成反应，即由氨基酸通过脱羧酶产生伯胺（primary amines）后，与indole-3-aldehyde（IAld）自发反应生成具有N=C双键的indolimines。通过与已知的脱羧酶进行序列对比，作者找到了摩氏摩根氏菌中可能的基因（aat），并通过异源表达验证了它利用氨基酸和IAld催化合成indolimines的能力。为了验证该基因的必要性，作者通过转座子插入的随机突变技术构建了含约16000个突变株的M.morganii菌株库，并利用优化了的Knockout Sudoku和转座子测序（Tn-seq）技术，得到了aat特异性敲除的突变株。该突变株不能产生indolimines，也失去了体外引发DNA断裂的能力。表明这种由aat基因编码的天冬氨酸氨基转移酶 (一种未被鉴定过的细菌脱羧酶)，它对indolimines合成至关重要。
最后，通过该突变体在无细胞和基于细胞的DNA损伤试验中都缺乏遗传毒性的情况下，作者进一步实验发现，与不产生indolimines的突变体相比，野生型 M. morganii增加了侏儒小鼠的肠通透性，并诱导了与异常DNA复制和肠上皮细胞增殖相关的转录特征。此外，在CRC小鼠模型的模拟微生物群落中，产生indolimines的摩氏摩根氏菌诱导结肠肿瘤负荷增加。
图4.（A）摩根分枝杆菌中吲哚胺生物合成机制；（C）indolimine表达含量检测
小结
作者通过建立评判肠道细菌功能的筛选体系，发现了微生物群衍生的小分子基因毒素的存在。为今后肠道菌群的研究拓展了研究思路和研究内容，并且为肠道菌群研究手段的革新也提供了一个很好的思路。曹议匀博士的这项工作不仅拓展了大家对肠道菌群的认识，更为以后结直肠癌的鉴定和诊断提供了一个很好的思路。
转自：“学术查”微信公众号
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