引言
如果说哪个蛋白功能被研究的最多，小编能想起来的恐怕就是P53，如果说哪个蛋白和诺贝尔奖关系最密切，小编能想起来的还是P53蛋白。
抗癌卫士——P53蛋白
今天推荐一篇lncRNA调控P53蛋白抑制肿瘤的研究，该文章的作者来自复旦大学上海癌症中心，文章近期发表在PNAS上。
题目
Inactivation of the tumor suppressor p53by long noncoding RNA RMRP.（LncRNA RMRP失活肿瘤抑制因子P53）
背景
P53是一个抑癌基因，它能够维持基因组完整性，防止细胞恶化，抑制癌细胞的生长、增殖和运动。50％以上的癌症中能够检测到P53基因的突变，并且在很多错综复杂的抑癌信号通路都和P53存在联系，提示P53对机体维持正常状态的意义。当然，除了基因突变能让P53蛋白失活外，机体内也存在一系列负调控机制让P53降解/失去作用，这也能影响肿瘤的发生发展。
LncRNA是一组具有调控作用的RNA，参与对癌症几乎所有方面的调节，包括基因组稳定性、细胞生长和永生、血管生成、转移和耐药。前期虽然有报道过多个LncRNA如MALAT1、MEG3、LincRNA-P21、ROR、PANDA等都参与调控P53。但这篇文章介绍的LncRNA是一种来自核糖体，RNA加工内切核糖核酸酶的RNA成分（RMRP）。文章证明它是一种p53失活剂，发挥促癌作用。
结果1：RMRP和预后的关系
作者首先从临床病例入手，分别用qPCR、原位RNA测定等方法对比癌组织和正常/癌周组织之间RMRP表达水平差异，然后结合不同患者的生存曲线，说明高表达的RMRP提示癌症预后较差。如图1所示。
图1 LncRNA RMRP在结肠癌中过度表达与不良预后相关
（A）RMRP在结肠癌中表达量高于正常组织；（B）与癌周组织相比，结肠癌组织中的RMRP表达更高；（C）较高的RMRP表达水平提示预后较差；（D）原位RNA测定直肠癌组织阵列，也显示癌组织中RMPR表达量高于临近组织；（E）直肠癌和邻近组织的RMRP染色分析；（F）直肠癌中高表达的PMRP与较差的总体生存率相关；（G）TCGA数据分析较高RMRP和较差的生存期相关
结果2：RMRP通过增强MDM2活性抑制p53
在证明高表达RMRP和结肠癌预后差相关后，作者开始探究RMRP发挥功能的机制。对敲除RMRP后的细胞进行转录组测序，发现p53相关的信号通路活性增强了，并且通过检测p53基因转录和蛋白含量的变化，确认RMRP参与了p53的翻译后修饰。p53蛋白要降解需要经过泛素化途径，其中一个E3泛素连接酶MDM2在p53的泛素化降解过程发挥重要作用，作者通过检测RMRP表达量变化前后p53及p53下游蛋白的变化，最终证明RMRP能够通过MDM2依赖的泛素化降解途径降解p53。结果如图2。
图2 RMRP通过增强MDM2诱导的P53降解来抑制p53活性
（A-B）RMRP过表达抑制p53下游基因的表达；（C-D）敲低RMRP增加了p53下游基因的表达；（E）敲除RMRP促进p53下游基因的表达；（F）过表达RMRP后p53蛋白含量降低；（G-H）敲低RMRP后p53及p53下游p21蛋白增加；（I）敲除RMRP后p53及下p21含量增加；（J-K）RMRP能够减弱5-FU诱导的p53激活；（L）蛋白酶抑制剂MG132能够阻断过表达RMRP造成的p53降解；（M）敲除RMRP能够延长p53存在时间；（N）RMRP促进MDM2依赖的p53降解
结果3：RMRP通过灭活p53促进癌细胞增殖
找到RMRP能够促进p53降解后，作者通过cck8、克隆形成、细胞周期等方法检测影响RMRP含量后癌细胞增殖活性的改变。结果显示RMRP能够促进癌细胞增殖。如图3所示。
图3 RMRP通过灭活p53促进结肠癌细胞增殖
(A) RMRP 的过表达提高了细胞活力;(B) RMRP 的过表达对p53缺失的细胞增殖没有影响;(C) RMRP 的过表达增强了细胞的集落形成能力，但不增强p53缺失细胞的集落形成能力; (D) 敲除RMRP抑制细胞的增殖;(E) RMRP 的敲低对p53缺失细胞的增殖没有影响;(F) RMRP 的敲低抑制p53阳性细胞而不是p53缺失细胞的集落形成能力;(G) 通过敲除RMRP显著促进细胞的增殖;(H) RMRP 敲除对p53缺失细胞增殖作用不明显;(I) RMRP 敲除显著抑制HCT116细胞的集落形成能力，但对p53缺失细胞的集落形成影响有限；(J)RMRP 敲低导致S期细胞群的减少；(K) RMRP 敲低对p53-缺失细胞周期没影响。
结果4：体内实验证明RMRP通过灭活P53促进癌症发展
作者将前面的细胞模型，在动物上制作荷瘤小鼠模型。检测小鼠成瘤情况，结果显示在体内RMRP也能够对肿瘤的增殖发挥促进作用，并且也能够检测到对p53的抑制。如图4所示。
图4 体内实验验证RMRP通过灭活p53 促进肿瘤生长
(A) RMRP 过表达能显著升高肿瘤体积；(B - C) RMRP 过表达增加了肿瘤的重量和质量； (D) RMRP 过表达抑制p53 和p21 蛋白表达；(E) RMRP 过表达抑制了p21 和PUMA的mRNA 表达；(F–H) RMRP 过表达对p53缺失细胞的肿瘤的生长影响微弱；（I- J）RMRP过表达不影响p53缺失细胞中p53下游靶基因表达；(K)与对照组相比，敲除RMRP抑制了平均肿瘤体积； (L -M) RMRP 的敲除减少了肿瘤的重量和质量；（N）RMRP敲除促进体内p53 和p21 蛋白表达；(O) RMRP 敲除激活 p21 和PUMA 的mRNA 表达。
结果5：小核核糖核蛋白多肽A对RMRP 介导的 p53 抑制是必需的
为了找到RMRP是如何调控MDM2影响p53降解的，作者通过RNApull-down的方法寻找RMRP相互作用的蛋白，找到来了SNRPA1这个蛋白能够和RMDM互作。并且验证发现SNRPA1能够在RMRP调控p53降解中起到桥梁作用。如图5所示。
图5. RMRP 通过 SNRPA1 抑制p53 活性
(A) RMRP 相互作用蛋白的鉴定；（B-C)免疫共沉淀检测RMRP与SNRPA1 相互作用；(D - E) p53 表达与SNRPA1 负相关； (H - I)结肠癌细胞中内源性SNRPA1 和 p53相互作用；(J)SNRPA1 过表达促进 p53 蛋白降解，HCT116p53+/+ 细胞中存在 MDM2。(K) SNRPA1 的敲低会增加p53+/+ 细胞中的p53 蛋白水平；(L)SNRPA1 促进 MDM2 诱导的p53泛素化；(M) SNRPA1 过表达通过细胞活力促进p53+/+结肠癌细胞的增殖；(N)敲低SNRPA1抑制 HCT116 p53+/+ 细胞的增殖；(O) SNRPA1 过表达对 HCT116 p53-/- 细胞增殖没有影响；(P) RMRP 的敲低对 HCT116 p53-/- 细胞增殖没有影响；(Q) 敲低SNRPA1 废除了 RMRP对p53的抑制；(R) SNRPA1 的敲低消除了 RMRP 诱导的癌细胞增殖；(S) SNRPA1 的过表达恢复因敲除RMRP造成的细胞增殖抑制。
结果6：RMRP通过分子伴侣介导的自噬防止SNRPA1 降解
为进一步搞清RMRP和SNRPA1的关系，作者找到和SNRPA1互作的LAMP2A蛋白，并证明LAMP2A蛋白在帮助SNRPA1通过细胞核膜时的作用。如图6所示。
图6 RMRP 通过干扰CMA 阻止SNRPA1 的溶酶体蛋白水解
(A - B)噬抑制剂CQ 能抑制SNRPA1降解，而MG132不能。(C)SNRPA1 中存在类似 KFERQ 的基序LKERQ，并且该基序突变为LKEAA；(D) SNRPA1 与HSPA8相互作用通过LKERQ基序；(E) 外源性SNRPA1 与外源性 LAMP2A 相互作用；(F)LAMP2A 过表达降低了 HCT116 p53+/+ 细胞中SNRPA1 的蛋白质水平；（G）LAMP2A的敲低增加了HCT116 p53+/+ 中 SNRPA1 的表达；(H) SNRPA1 蛋白在 HCT116 p53+/+ 细胞中的细胞分布；(I) 敲除RMRP降低了细胞核中的SNRPA1 水平，同时增加 SNRPA1 在HCT116 p53+/+ 细胞中的细胞质积累； (J) RMRP 的敲除增强了SNRPA1和 HSPA8的相互作用。
结果7：C/EBDβ-RMRP-P53信号通路决定肿瘤对PARP的敏感性
为了验证RMRP是如何被激活进而抑制p53活性，作者从该基因的启动子入手，寻找能够调控该基因转录的分子。首先通过荧光素酶实验找到该基因的重要启动子位置，然后分析哪些转录因子可能影响RMRP的转录，筛选到C/EBDβ能够激活RMRP的转录。最新的报道又显示RARP-1能够使C/EBDβ失活，经验证发现敲低RARP-1确实能够增加RMRP的量，并且对下游的p53确实发挥调控作用，这些结果最终绘制了一个较完整的信号通路。如图7所示。
图7 C/EBPβ-RMRP 轴赋予结直肠癌对PARP 抑制的抗性
(A) 荧光素酶报告基因对RMRP 启动子活性的评估；(B) RMRP 表达是通过单独敲除 HCT116 p53+/+ 细胞中的11 个TF 来确定的；(C) RMRP 约 500-bp 区域的示意图；(D) C/EBPβ 过表达上调 HCT116 p53+/+ 细胞中的RMRP 水平；(E)荧光素酶实验发现C/EBPβ 的过表达会触发RMRP 启动子（~500bp）活性；(F - G) C/EBPα 和β 与通过ChIP 测定的RMRP 启动子；(H) RT-qPCR检测 RMRP 的表达可由PARP 抑制剂诱导。(I) 敲除PARP-1 上调HCT116 p53+/+ 中的RMRP 水平；(J - K) RMRP 的敲除使癌细胞对 Olaparib 诱导的p53 激活敏感；(L)低剂量的Olaparib 显著抑制 RMRP 基因敲除的结肠直肠癌细胞的增殖，但不抑制RMRP 基因敲除的结肠直肠癌细胞；(M) 敲除RMRP使结肠直肠癌细胞对Olaparib 敏感；（N - O）RMRP的敲除使结直肠癌细胞对联合使用奥拉帕尼与基因毒性剂顺铂敏感。(P)RMRP 诱导的结直肠癌通过阻止p53 激活对PARP 抑制剂产生抗性的模式图。
转自：“学术查”微信公众号
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