以下文章来源于新青年植物学家 ，作者新青年植物学家
钾离子是植物体内最重要的阳离子之一，占植物干重的2%-10%，参与植物多种重要生理过程。植物主要通过两种钾离子吸收运输机制来维持正常的生理代谢活动，分别为高亲和吸收机制（钾转运蛋白介导）和低亲和吸收机制（钾离子通道蛋白介导）。在植物保卫细胞中，钾离子通道调节钾离子进出，影响细胞渗透压，调节细胞体积，实现气孔运动，在植物气体交换、光合作用及水分蒸腾中居于关键地位。
2022年10月20日，英国格拉斯哥大学Michael R. Blatt教授团队在Nature Plants期刊（IF=17.352，SCI一区top）发表论文“Engineering a K+ channel 'sensory antenna' enhances stomatal kinetics, water use efficiency and photosynthesis”。2011-2018年，我作为Blatt教授博士生及实验组博士后，参与了这项工作，回国后也继续补充了一些数据，论文发表时将我列为共同指导作者。借用我们的“青年植物学家”公众号平台，分享我对这项工作的理解。
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GORK是电压门控钾离子通道，介导跨细胞膜钾外流，其突变体气孔关闭减慢（Hosy et al. 2003）。作为电压门控钾离子通道，GORK门控受到胞外钾离子浓度与去极化膜电压影响（Jezek and Blatt, 2017）。在前期工作中，我们发现当胞外钾离子浓度达到0.1 mM时，GORK会在细胞质膜上聚集成簇，而在100 mM钾浓度下成簇现象消失（图1），同时，添加钾离子通道阻断剂Ba2+也会导致GORK簇消失，提示这一现象与GORK钾通道门控有关（Eisenach et al. 2014）。因此，我们针对这一现象背后的机制开展研究。
图1. GORK在不同钾离子浓度下的成簇现象（原图来自Eisenach et al. 2014）
植物中电压门控钾离子通道以四聚体形式存在。每个组成参与四聚体的通道蛋白由S1-S6六个跨膜结构域组成，其中S1-S4在外侧为电压感受区域，S5-S6参与组成钾离子通过孔（图2），因此两个GORK蛋白的VSD区域间相互作用可能是蛋白互作乃至于该蛋白成簇现象出现的关键。首先，我们利用mbSUS技术检测了GORK与钾内流离子通道KAT1互作情况，发现内外流通道间不存在互作，接下来，通过GORK-KAT1序列重组交换，逐步确定GORK蛋白N端区域参与决定蛋白互作（图3）。
图2. Kv通道亚基结构示意图(上)六个，跨膜α螺旋(S1-S6)，中间环(L1-L4)和嵌合交换点(-)。
图3. GORK VSD (gVSD)和KAT1 VSD (kVSD)的嵌合体与全长GORK通道互作。
针对GORK蛋白N端区域氨基酸序列比对与分析，我们发现GORK上存在特殊的氨基酸残基正负电荷交替分布，进一步对这些氨基酸突变筛选后发现正负电荷残基交替出现是GORK蛋白VSD区域间互作的关键（图4A）。正负电荷交替残基区域对蛋白互作影响通过rBiFC法在烟草中进行了验证（图4B）。这一残基电荷情况对于GORK蛋白二聚体的形成，也通过在大肠杆菌中表达通道蛋白N端并进行凝胶过滤层析色谱，从蛋白分子量分布情况得到验证（图4C）。
图4. GORK蛋白VSD区域特殊氨基酸残基电荷分布影响蛋白互作
接下来，探索GORK蛋白VSD区域特殊氨基酸残基电荷分布是如何影响GORK蛋白成簇现象及通道活性的。首先，我们将融合GFP的GORK及残基电荷分布突变GORK蛋白在pGC1启动子控制下在拟南芥气孔中特异性表达，结果如图5A所示，残基电荷分布改变影响GORK间蛋白互作，也会影响不同外界钾浓度下成簇现象。利用电生理技术，在非洲爪蟾卵母细胞（图5B）及拟南芥保卫细胞（图5C）中，我们发现GORK蛋白残基电荷分布变化会导致其I-V曲线对不同钾浓度响应改变。以V1/2表示，影响成簇现象的序列改变将导致GORK对钾浓度变化响应改变，如高钾浓度才可以使突变蛋白（GORKNP）V1/2与野生型蛋白相当，表明外界钾对通道门控的抑制作用在突变蛋白组成通道中减弱。
图5. 影响GORK蛋白成簇现象的残基电荷分布改变也会影响GORK通道门控对外界钾浓度敏感性
基于以上实验结果，下一个要解决的问题就是GORK成簇现象对气孔运动及植物水分利用的生理层面影响。为了指导进一步实验工作，我们利用课题组开发的OnGuard3软件模拟了GORK突变对气孔功能的影响。OnGuard系列软件最早在2012年发布，是通过整合与气孔运动相关的离子转运体系、相关渗透溶质的代谢反应、细胞内pH和游离钙离子等, 与气孔运动密切相关且必要的分子生物学、生物物理学以及动力学的信息, 通过定量系统的分析方法建立的计算生物学模型（何冰清等，2021）。浙江大学王一州研究员回顾了气孔建模工作的发展历程和研究现状，并对OnGuard系统进行了介绍（何冰清等，2021）。通过设置OnGuard3软件中GORK参数，我们预测蛋白残基电荷分布改变带来的GORK功能变化（GORKNP）将会加速气孔关闭。
在拟南芥gork突变体中，我们回补了野生型GORK，电荷改变GORK蛋白，并检测了在交替光暗变化下的气孔开闭情况，验证了OnGuard3软件预测结果（图6A）。由于GORK蛋白残基电荷分布改变（如GORKNP）会加速气孔关闭，我们猜测在光照变化情况下（设想自然环境下多云天气），这一改变将对植物水分利用效率有利。实验结果显示表达GORKNP的拟南芥植株在干旱胁迫及光照变化条件下生物量较高（图6B），提示水分利用效率提升，且这一变化与光合作用效率无关（图6C）。
图6. GORK蛋白残基电荷分布改变加速气孔关闭并提高植物水分利用效率
我们的工作揭示了GORK通道成簇现象机制及其对通道门控特性的影响规律，发现VSD的N端区域氨基酸残基电荷特殊分布与蛋白互作及成簇现象的关系（图6D）。同时，我们对GORK蛋白N端区域氨基酸残基电荷分布进行改变，调整其门控特性，将可以在不影响光合作用的情况下提高植物气孔运动速率及水分利用效率，为基于气孔离子通道的遗传改良提供新的思路。
在植物离子通道中，类似GORK的成簇现象在内流钾离子通道KAT1中也存在，课题组前期工作发现KAT1在细胞膜上成簇出现，在ABA处理下该现象消失，且KAT1通过SNARE蛋白SYP121介导的途径转运入细胞内部，是KAT1活性调控的机制之一（Sutter et al. 2006, 2007）。然而，GORK与KAT1的成簇机制及功能具有区别，是否其它通道蛋白也存在类似调控机制，值得探讨。基于通道调控机制的改造，也在提高植物水分利用效率，光合作用效率乃至于胁迫抗性提升中具有重要意义。对于GORK蛋白N端区域筛选显示氨基酸残基电荷交替分布在蛋白互作中起重要互作，这种蛋白结合很可能是基于两个蛋白该区域正负电荷吸引形成。GORK可能在不同外界钾离子浓度带来的跨膜电势差影响下暴露出残基电荷交替分布区并导致互作及成簇现象出现。在蛋白互作筛选过程中，也可以看到GORK与KNGS1-L4和KN-L1GS2-L4存在较弱互作，是否GORK上存在第二个决定成簇现象的位点值得探讨。
—◐ 后记
回顾项目完成过程，应当说是99%的汗水加上1%的灵光闪现。记得项目开始很长时间，我都在和一作Wijitra疯狂筛选互作位点，在想到残基电荷之前，我们甚至开始穷举所有氨基酸突变可能（supplement figure 3-5展现了部分我们的疯狂工作）。应当说那段时间充满了重复失败与痛苦煎熬，GORK本身扩增与分子克隆极为困难，很多个下午讨论毫无头绪后都是我俩在common room里唉声叹气。然而，在汗水与辛劳基础上的灵光闪现最让人难忘，在和到时Blatt教授开的第N次碰头会上，我们突然想到最简单的可能，表面电荷分布。这之后实验验证的猜想，进度飞快，其中快乐难以言表。应当说科研工作充满了负反馈，正反馈的快乐往往很短暂，没有大心脏和静得下来坐得住的心态，很难做成事情。最重要的是要感谢导师Blatt教授，他始终以最乐观的态度鼓励我们，并容忍我们的各种各样错误与尝试，在关键节点提供支持与点拨，使我们能够维持对科学研究的兴趣并体会探索未知的快乐。
转自：“iPlants”微信公众号
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