乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤之首，全球每年死亡病例高达40万人。三阴乳腺癌（TNBC）是其中恶性程度高、侵袭性较强，易发生转移的一类，5年生存期仅有10%左右［1］。目前TNBC的治疗手段较为单一，以手术为主，辅以放化疗。主要的化疗方案为蒽环类和（或）紫杉类细胞毒药物，但这类传统的化疗方案治疗效果有限，且不良反应大［2］。因此，寻求靶向治疗药物或天然产物以及天然产物与临床现有药物的联用方法成为TNBC研究的热点之一。
从天然物质中提取的活性成分在肿瘤治疗中广泛应用，具有疗效好、毒副作用小的优点。近年来，多糖因具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、降血糖等多种重要的生物学活性受到越来越多的关注［3-4］。香菇多糖是一种真菌多糖，主要有效成分为β-1，3-葡聚糖，具有良好的抗肿瘤、抗病毒及免疫调节作用。诸多研究发现香菇多糖具有预防肿瘤的作用，单独使用或与其他化疗药物联合使用在多种癌症（如卵巢癌、胃癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等）中均表现出较好的抗肿瘤作用，并且与化疗药物联用时能够降低化疗药物的毒副作用［5-6］。当前，香菇多糖在临床上已被用作化疗药物的辅助药，用以提高乳腺癌患者化疗后的免疫功能，改善患者的生存质量［7］。然而关于香菇多糖治疗TNBC的研究较少，分子机制尚不明确。本研究拟通过网络药理学，筛选出香菇多糖治疗TNBC的关键靶点，结合体外细胞活性检测技术和活体成像技术，更直观的监测香菇多糖对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对筛选得到的关键基因进行验证，为后续香菇多糖治疗TNBC的分子机制研究提供佐证及基础。
1 材料
1.1 细胞及实验动物
小鼠TNBC细胞4T1和人TNBC细胞MDA-MB-231购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，荧光素酶标记4T1（4T1-Luc）细胞由本实验室构建并保存。
SPF级雌性BABLC小鼠，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2016-0011，动物实验在浙江大学药物安全评价研究中心进行，遵守本机构实验动物管理与使用委员会（IACUC）规程并经审核批准，批准文号IACUC-21-368。
1.2 试剂及仪器
香菇多糖片，购自湖北广仁药业有限公司，规格10 mg，批号2102020，国药准字H42022727；香菇多糖（原料药，货号S5083，生产批号S508302）购自selleck公司；磺酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）购自美国SIGMA-ALDRICH公司；Tris-base购自安徽Biosharp公司；荧光素酶购自美国MedChem Express公司；qRT-PCR试剂盒购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；Trizol试剂购自上海生工生物工程有限公司；逆转录试剂盒购自TAKARA公司；其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
Lumina III小动物活体成像系统购自美国PerkinElmer公司；FAST 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；Varioskan Flash酶标仪购自美国Thermo公司。
2 方法
2.1 网络药理学预测香菇多糖治疗TNBC的作用机制
2.1.1 TNBC和香菇多糖相关靶点筛选 打开PubChem数据库“https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/”，输入“lentinan”（香菇多糖的英文名）搜索得到化合物，复制SMILES号。通过SwissTarget Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、TCMID（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）和GeneCards（http：//www.genecards.org）预测香菇多糖的潜在靶点。利用GeneCards和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/search）数据库，以“triple negative breast cancer”为关键词，搜索TNBC疾病相关靶点。随后利用R语言软件分析得到香菇多糖和TNBC共同靶点，作为香菇多糖治疗TNBC的潜在作用靶点。
2.1.2 靶点GO及KEGG分析 利用Sangerbox平台（http：//sangerbox.com/）的ClusterProfiler模块对香菇多糖治疗TNBC的潜在作用靶点进行基因本体论（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并利用气泡图绘制工具对排名前20的通路进行可视化分析。
2.1.3 蛋白质相互作用（PPI）网络分析 将潜在作用靶点输入String数据库（https：//STRING-db.org/），获得PPI网络，将minimum required interaction score选项设为high confidence（0.700）。随后将String数据库的输出文件导入Cytoscape 3.7.2软件，进行PPI可视化操作，并设置Network Analyzer插件中的度值和介数评估靶点的重要性，使用cytohubba插件，设置得到排名前10的hub基因。
2.1.4 潜在作用靶点的相关转录因子及调控基因富集 将潜在作用靶点输入MetaScape软件（https：//metascape.org/gp/index.html），使用Express Analysis和Custom Analysis选项对靶点进行分析，得到潜在作用靶点的相关转录因子及调控基因富集结果。
2.2 实验验证
2.2.1 细胞增殖抑制实验 取处于对数生长期的4T1和MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，贴壁过夜后，分别加入不同浓度梯度（终浓度为31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg·mL-1）的香菇多糖原料药，对照组不加药。作用72 h后，采用10%三氯醋酸4 ℃固定2 h，4 mg·mL-1 SRB染色20 min，1%乙酸清洗去除多余染料后，10 mmol·L-1 Tris-base溶解后，515 nm波长下测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝A给药/A对照
2.2.2 小鼠TNBC模型制备及给药 选取15只健康雌性BABLC小鼠，sc接种1×106个4T1-Luc细胞。待肿瘤平均总光子数达到1×107 p·s-1后，随机均分为3组：模型组和香菇多糖低、高剂量（100、200 mg·kg-1香菇多糖片）组。按10 mL·kg-1体积ig给药，对照组给予等量生理盐水，每天1次，持续3周。每周采用小动物活体成像系统对小鼠进行化学发光成像。
2.2.3 qRT-PCR技术验证香菇多糖治疗TNBC的主要基因表达［8］ 给药结束后，剖取小鼠肿瘤组织，提取总RNA并逆转录合成cDNA。Primer 5设计引物（表1），内参为18S rRNA基因，用7500 Fast Real-Time PCR仪进行荧光定量PCR反应检测STAT3和VEGFA的表达。采用相对值2-△△Ct进行数据处理。
2.3 统计学方法
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据符合shapiro-wilk（S-W）正态分布检验，定量资料应用±s进行描述，组间比较采用one-way ANOVA进行检验。
3 结果
3.1 香菇多糖治疗TNBC相关靶点分析
通过TCMID和SwissTarget Prediction数据库检索得到香菇多糖相关靶点84个。TNBC相关靶点由GeneCards和DisGeNET数据库获得，共3 399个。R软件分析得到52个香菇多糖治疗TNBC相关靶点。结果见图1。
3.2 香菇多糖治疗TNBC靶点GO及KEGG分析
通过Sangerbox将GO分析分为3个部分：生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF），选取前20位的功能富集（图2）。香菇多糖治疗TNBC的靶点主要涉及磷酸酶结合、受体调节活性等MF，参与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）调控、体液水平调节、细胞外调节蛋白激酶（ERK）1-ERK2调节、正向调控细胞黏附等BP，并发现此类靶点富集于膜筏、膜区、细胞外基质等CC。通路富集结果发现靶点主要涉及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）、晚期糖基化终产物及其受体（AGE-RAGE）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）、MAPK信号通路和肿瘤蛋白多糖（proteoglycans，PGs）相关通路。
3.3 PPI分析
将香菇多糖治疗TNBC的52个潜在靶点进行PPI分析，共得到VEGFA、STAT3、MAPK1、IL2、TNF、RELA、AKT1、MAPK3、BCL2L1和HSP90AA1 10个hub基因（图3）。
随后通过Metascape富集分析结果发现，这10个hub基因主要参与胃泌素和白细胞介素等信号通路（图4）。
3.4 潜在作用靶点的相关转录因子及调控基因富集
相关转录因子及调控基因富集分析发现，香菇多糖治疗TNBC的潜在靶点富集的相关转录因子靶区主要是CDC5 01、NFKB C、CP2 02、AR Q6等（图5-A）。另一项相关调控基因富集结果发现，这些靶点主要受SP1、RELA、JUN、TP53、NF-kB1、STAT1h和STAT3等基因调控（图5-B）。
3.5 实验验证
细胞增殖抑制实验结果显示，与对照组比较，香菇多糖对4T1和MDA-MB-231细胞存活率均有显著抑制作用（P＜0.05、0.01），且作用呈浓度相关性。结果见表2。
在给药14、21 d后，与模型组比较，香菇多糖能够剂量相关性地抑制小鼠TNBC肿瘤的生长，高剂量组差异显著（P＜0.05、0.01），21 d抑制率达到（91.9±4.7）%。结果见图6、表3。
基于网络药理学的分析结果，在TNBC动物模型中对2个关键靶基因进行qRT-PCR验证。结果显示，与对照组比较，香菇多糖给药后能够剂量相关性抑制STAT3和VEGFA的mRNA表达，高剂量组差异显著（P＜0.05、0.01），见表4，提示香菇多糖可抑制JAK-STAT相关信号通路，减少肿瘤血管生成。
4 讨论
TNBC是女性常见的恶性肿瘤，其发病机制复杂，临床治疗手段单一，预后不佳，已逐渐成为女性死亡率最高的肿瘤疾病，严重危害女性生命健康。香菇多糖是从香菇的子实体中提取分离的多糖，现代药理学研究表明香菇多糖毒副作用小，且具有多种生物活性功能，故而被广泛用于治疗恶性肿瘤及病毒性肝炎等疾病［9］。临床上香菇多糖已被证实具有抗肿瘤作用，并能减轻化疗的毒副作用，增强疗效［7］，但是香菇多糖治疗TNBC的分子机制尚不清晰。
本研究通过体外细胞增殖抑制实验证明了香菇多糖对人源和鼠源TNBC细胞（MDA-MB-231和4T1）增殖均具有抑制作用，进一步建立4T1-Luc细胞小鼠TNBC移植瘤模型，小动物活体成像监测结果也证实香菇多糖能够明显抑制小鼠TNBC模型体内肿瘤细胞的生长。本研究应用网络药理学分析香菇多糖抑制TNBC的潜在作用机制及靶点，经GO和KEGG富集发现，这些潜在靶点与PI3K-Akt、AGE-RAGE、HIF-1、RAP1和肿瘤PGs相关通路相关。在多数肿瘤中，PI3K-Akt相关信号通路被视为与肿瘤细胞增殖、代谢等密切相关，是新药研发的热门靶点，能够被多种信号通路激活，影响下游分子信号。HIF-1α是HIF的主要亚型之一，是调节血管内皮生成因子（VEGF）表达的关键蛋白，也是恶性肿瘤乏氧环境不可缺少的调节蛋白，与肿瘤血管新生密切相关［10］。PGs是细胞表面和细胞周围微环境中一个重要的分子效应器，可参与调节肿瘤发生、血管生成等重要生物过程，目前研究显示PGs可影响肿瘤细胞增殖、黏附、迁移和侵袭能力［11-12］。肿瘤细胞增殖迁移过程中，AGE-RAGE可以有效激活细胞内的氧化应激效应，引发细胞内活性氧簇（ROS）的大量积聚，引发机体氧化应激和炎症反应［13-14］，同样Rap1信号通路以及RELA（p65）基因也被证实与机体炎症反应相关［15-16］，参与调节NFKB水平，而HSP90AA1、BCL2L1和TNF等基因与肿瘤细胞的缺氧、凋亡、坏死密切相关［17-20］。此外，MAPK信号途径也是经典的生物信号调节通路，在体内涉及广泛的生物学过程，其中Ras/Raf/MEK/ERK通路是近年来研究比较热门的通路之一，与肿瘤细胞的增值、分化等过程密切相关［21］，这也与富集结果发现的ERK1-ERK2信号调节和PPI分析中得到的MAPK1/3基因一致。JAK-STAT信号通路是一个进化保守的信号级联反应，参与肿瘤细胞的增殖、分化、血管生成以及机体免疫调节等过程，影响Ras/MAPK、PI3K和TGF-β等信号通路，还可被IL2激活，STAT3表达增加，增强机体免疫细胞如T细胞、B细胞、NK细胞的免疫活性［22-24］。上述网络药理学分析结果表明，香菇多糖可通过调节PI3K-Akt、Ras/Raf/MEK/ERK和JAK-STAT等信号通路调节机体免疫，诱导细胞凋亡，减少氧化应激和炎症等多途径抑制肿瘤的生长。基于此，本研究继续采用qRT-PCR技术对香菇多糖治疗小鼠TNBC模型的核心靶点进行验证，结果再次证实经香菇多糖给药后小鼠肿瘤中STAT3和VEGFA基因的表达显著降低。
本研究采用网络药理学和实验验证探讨了香菇多糖抑制TNBC的可能作用机制，香菇多糖可通过抑制JAK-STAT相关信号通路和减少肿瘤血管生成抑制TNBC的生长。此外，网络药理学分析结果提示香菇多糖还可能通过抑制PI3K-Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路、调节机体免疫，诱导细胞凋亡，减少氧化应激和炎症等多途径抑制肿瘤的生长。本研究扩充了香菇多糖的抗肿瘤作用机制研究，也为香菇多糖用于治疗TNBC提供理论参考和数据支撑。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：代晓阳，张燕，王红磊，赵家熙，杨晓春，翁勤洁．基于网络药理学和实验验证探讨香菇多糖抑制三阴乳腺癌的作用机制 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(10): 2031-2038 .
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