今天和大家分享一篇于2022年6月在Frontiers in Immunology上发表的一篇影响因子为7.561的纯生信文章"Identification of Biomarkers Associated With CD8+ T Cells in Coronary Artery Disease and Their Pan-Cancer Analysis"，作者首先利用GEO的冠状动脉疾病的mRNA表达数据，利用WGCNA来鉴定hub基因，并且利用和CD8+T细胞的浸润水平的相关性来验证hub基因，进一步下载泛癌数据来探讨hub基因在不同癌症中和CD8+T细胞浸润程度的相关性。分析了hub基因的甲基化水平，hub基因之间在不同癌症中的相关性，以及在不同细胞系中的相关性。并且进行了小分子药物靶点分析，预测了多种可以用于治疗冠心病的药物。最终，进行了GSEA富集分析。那么整篇文章围绕hub基因的挖掘和验证进展，具体是如何实现的呢，让我们一起来学习一下吧！
1
背景
1.冠心病是最常见的一种心血管疾病，并且是人类死亡的主要原因。时至今日，冠心病诊断的金标准仍然是冠状动脉造影，一种有创的，并且对医疗条件有要求的诊断方式。CD8+T细胞在动脉粥样硬化斑块中是比较重要的一种免疫细胞，动物实验表明细胞毒性CD8+T细胞促进坏死核心的形成并加剧了斑块的进展。
2. 癌症，高发病率，高死亡率
3.近年来，生物信息学分析方法已被用于深入了解疾病的潜在病理生理机制。其中，加权基因共表达网络分析(WGCNA)是一个广泛使用的生物信息学分析工具，它可以挖掘出与疾病免疫反应最相关的基因表达模块。从中可以进一步筛选出枢纽基因。CIBERSORT是另一种生物信息学分析方法，可以确定通过免疫细胞的表达来确定样本中免疫细胞的浸润情况。并且，结合应用WGCNA和CIBERSORT来探索潜在的生物标志物已被普遍用于肿瘤学。
4. 在近期一些研究中提到，癌症病人常常合并心血管疾病，特别是冠心病。那么，两种疾病之间到底存在着什么样的联系呢，下面介绍的这篇文章，就是探索预测潜在的可能的生物标志物来探寻两种疾病之间的关系。
2
方法
（一）数据获取：1.GEO：GSE12288、GSE34198、GSE66360。 2.TCGA3.CCLE4.GETx
（二）GSVA基因集的变异分析，来探索相关基因的潜在作用。
（三）WGCNA
首先使用“CIBERSORT”确定每个样本中免疫细胞的丰度，然后选择每个样本中7种T细胞亚型的部分来进行接下来的WGCNA分析。基于GSE12288中与7种T细胞亚型相关的基因的表达水平，使用R包“WGCNA”构建基因共表达网络。然后，根据Pearson相关系数，对该数据集中的样本进行了聚类分析。其中，软阈值β = 3。
（四）GO和KEGG富集分析对模块中的hub基因进行了GO和KEGG富集分析，对潜在的可能的机制进行研究
（五）确定hub基因并进行验证
利用GSE12288，GSE34198，GSE66360三个数据集中，hub基因与CD8+T细胞浸润水平的相关性，确定最终的可靠的hub基因。利用最终确定的hub基因在TIMER数据库中与CD8+T细胞的相关性，对hub基因进行验证。
（六）hub基因甲基化分析从DiseaseMeth 2.0数据库获得与冠状动脉疾病中3个hub基因甲基化水平相关的数据。分析其甲基化水平是否显著。
（七）hub基因之间的相关性进行3个hub基因在GEO数据集中的相关性分析，以及在不同癌症中的相关性分析，在不同细胞系中的相关性分析。
（八）药物靶点分析将3个hub基因输入Connectivity Map药物数据库，来确定可用于治疗冠状动脉疾病的药物
（九）GSEA基因富集分析
选择“h.all.v7.4.entrez.gmt”和“c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt”作为参考基因组，进行基因的富集分析，探究其潜在的机制通路。
3
结果
1.GSVA
为了研究GSE12288数据集中与CAD相关的基因的潜在作用，作者进行了GSVA分析。这些基因在一些免疫相关的途径中明显富集，如IL-6 jak stat3信号，干扰素-γ反应，和IL-2 stat5信号。
2. WGCNA
四个模块中的蓝色模块与T细胞CD8（CD8+ ）的关系最为显著。根据截断标准（module affiliation >0.8和gene significance >0.5），选择了9个基因（PAX8, ATP6V0C, MMP14, PSMF1, RAD23A, PRDX6, MKRN1, YBX3, FBXO7）。
3. GO和KEGG富集分析
1：GO富集分析：
BP：调节蛋白质分解代谢过程，细胞氨基酸代谢过程
CC：蛋白酶体复合体、内肽酶复合体和黑色素体
MF：泛素蛋白连接酶结合，泛素类蛋白连接酶结合，以及蛋白酶体结合
2：KEGG富集分析：亨廷顿病，蛋白酶体，和帕金森病
4.hub基因的鉴定和验证
分析结果显示，在GEO三个数据集中，FBXO7、RAD23A和MKRN1这三个枢纽基因都与CD8+T细胞的浸润程度显著正相关。
研究发现，FBXO7的表达值也与几种癌症的CD8+T细胞浸润程度明显正相关，其次是RAD23A和MKRN1。
5. hub基因的甲基化结果
FBXO7的甲基化水平明显较低，RAD23A的甲基化水平较高，而MKRN1的甲基化结果没有统计学意义。
6. hub基因的相关性分析
分析显示，在GSE12288、GSE34198和GSE66360三个数据集中，FBXO7、RAD23A和MKRN1之间存在显著的正相关关系。
作者接下来分析了不同癌症中FBXO7、RAD23A和MKRN1之间的相关性。除了USC、MESO和CHOL，FBBXO7在其余癌症中与MKRN1明显正相关。除MESO、LGG、UCS、CHOL、READ和BRCA外，其余癌症的MKRN1与RAD23A呈明显正相关。除UVM、CHOL、UCS、SKCM外，其余癌症中MKRN1与RAD23A呈明显正相关。FBXO7与MKRN1在细胞系中的相关性见下图，FBO7与RAD23A在细胞系中的相关性见下图，MKRN1与RAD23A在细胞系中的相关性见下图。FBXO7与心脏组织中的MKRN1呈显著正相关，FBXO7与心脏组织中的RAD23A呈显著正相关，MKRN1与心脏组织中的RAD23A呈显著正相关。
7.药物预测
作者将FBXO7、RAD23A和MKRN1输入camp database，最终确定了11种可用于治疗冠心病的药物，包括多柔比星、加巴喷丁、苏西布宗、普拉通、卡瓦因、5255229、下降、纳布啡、MK-801、三甲氧嗪和GW-8510。
8.CircRNA-miRNA-hubgene 网络
9.GSEA富集分析
基于 "h.all.v7.4.entrez.gmt "和 "c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt "作为参考基因组，作者发现与FBXO7、RAD23A和MKRN1相关的样品中富集的基因组的完整列表。当使用“h.all.v7.4.entrez.gmt”作为参考基因组时，FBXO7与同种异体排斥反应，干扰素-γ响应和TNFα信号传导富集相关。除了炎症反应和干扰素-α反应外，RAD23A富集的五个基因集中的其他三个与FBXO7的相同。MKRN1在六个基因集富集，除了其中五个与RAD23A富集结果相同，另一组PI3k-Akt-MTOR信号是MKRN1特有的。当使用“c2.cp.kegg.v7.4.entrez.gmt”作为参考基因组时，FBXO7富集了三组基因集，包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病HCM、NOD样受体信号通路。RAD23A富集了6个基因集，其中三个与FBXO7相同，另外三个在B细胞受体信号通路、移植物抗宿主病和致心律失常性右心室心肌病富集。MKRN1在四个基因集富集，三个与FBXO7富集结果一致。
4
小结
本研究思路新颖，将冠心病的生物标志物与肿瘤免疫微环境结合起来，使用GSE12288数据集进行WCCNA分析来鉴定与CD8+ T细胞最相关的模块，然后进一步进行以下分析：利用GSE34198和GSE66360数据集验证hub基因FBXO7、RAD23A和MKRN1；这些hub基因表达水平与CD8 +T细胞浸润在CAD和多种癌症中呈正相关；使用hub基因预测CAD的潜在有效治疗药物；进行GSVA分析来进一步了解CAD和癌症之间的潜在生物学途径，例如IL6 JAK STAT3信号传导，干扰素-γ响应（IFN-γ）和IL2 STAT5信号传导等；对三个hub基因进行单基因GSEA分析。总之，作者将FBXO7，RAD23A和MKRN1鉴定为冠心病与CD8 + T细胞介导的免疫反应相关的生物标志物，同时它们又在各种癌症中起到潜在治疗靶点的作用。
转自：“科研人直通车”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
