吉林师范大学揭示ＢＭＰ４ 重组蛋白在毕赤酵母中表达载体构建与纯化分析

骨形态发生蛋白４（ＢＭＰ４）是骨形成蛋白家族的一员，隶属于ＴＧＦ－β超家族，在调节胚胎发育、干细胞分化和成人组织稳态等方面起重要的调控作用。以骨形态发生蛋白（ＢＭＰ４）为研究对象，将ＢＭＰ４基因与ＩｇＧ － Ｆｃ 基因结合，改造成为ＢＭＰ４ － Ｆｃ融合蛋白，经巴斯德毕赤酵母诱导表达和 ＤＥＡＥ 阴离子纯化获得目的蛋白，并利用间充质干细胞验证了其生理活性。结果表明：使用巴斯德毕赤酵母能够很好表达ＢＭＰ４－Ｆｃ融合蛋白，通过提纯条件，成功分离纯化 ＢＭＰ４ － Ｆｃ融合蛋白，其生理活性达到商业化纯品水平，为ＢＭＰ４生产与开发提供了新路径。

一

重组质粒 Ｘ３３ 毕赤酵母鉴定与筛选

将目的质粒通过电转化法构建重组Ｘ３３毕赤酵母表达载体，酵母菌菌落 ＰＣＲ 实验结果见图３，结果显示２，３，４号菌种有ＰＣＲ产物，证明目的基因已导入到酵母菌中．ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ实验结果见图４，结果显示在相对分子质量为４５０００处，１ — ４号菌种均有蛋白分泌。

02

重组蛋白纯化

 重组蛋白阴离子交换层析：将蛋白原液加入阴离子柱，用２０ｍｍｏｌ ／ Ｌ　Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ和不同浓度梯度的ＮａＣｌ混合液进行洗脱．当 ＮａＣｌ浓度为１００ｍｍｏｌ／Ｌ时，洗脱结果见图９ ，目的蛋白被３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ和２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ混合液洗脱；当 ＮａＣｌ浓度为５０ｍｍｏｌ／ Ｌ 时，洗脱结果见图１０ ，目的蛋白被２５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ和２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ － ＨＣｌ混合液洗脱；当 ＮａＣｌ浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ 时，洗脱结果见图１１ ，目的蛋白被２３０ｍｍｏｌ／ ＬＮａＣｌ和２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ － ＨＣｌ混合液洗脱，说明该浓度洗脱液可得到较高纯度目的蛋白。

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重组蛋白活性测定及数据分析

分别用磷酸缓冲盐溶液、商品化ＢＭＰ４与纯化后的ＢＭＰ４－Ｆｃ ，对间充质干细胞进行刺激，培养４８ｈ后加入１０ μ Ｌ细胞计数试剂ＣＣＫ－８培养２ｈ，用酶标仪检测Ｄ（ ４５０ ）值，结果见图１２。分析结果显示，商品化ＢＭＰ４组 Ｄ （ ４５０ ）比 ＰＢＳ组显著增高， ＢＭＰ４ －Ｆｃ组Ｄ （ ４５０ ）比ＰＢＳ组显著增高，商品化 ＢＭＰ４组Ｄ（ ４５０ ）略高于ＢＭＰ４ － Ｆｃ组但差异不显著，说明ＢＭＰ４ － Ｆｃ对间充质干细胞的刺激程度较低，接近商品化ＢＭＰ４对间充质干细胞的刺激水平。

蛋白类药物通过血液进入体内循环时，由于半衰期比较短通常需要对患者加大给药剂量，因而会产生副作用。ＢＭＰ４ 作为骨形成蛋白家族的一员，对其生理活性的研究与功能开发利用一直受到众多学者的重视。近年来对ＩｇＧ － Ｆｃ 标签的研究越来越多，发现 Ｆｃ 标签可以促进蛋白形成稳定二聚体，可延长在血液中的半衰期，降低蛋白免疫原性，从而减少患者给药量、减轻对患者的毒副作用．本文依据 ＢＭＰ４可通过形成二聚体发挥其生理作用的特点，在 ＢＭＰ４基因组中加入了ＩｇＧ － Ｆｃ标签。研究结果显示，当ＢＭＰ４与 ＩｇＧ － Ｆｃ融合后会促使ＢＭＰ４ － Ｆｃ融合蛋白形成不易降解的稳定二聚体；同时，ＢＭＰ４ － Ｆｃ融合蛋白对间充质干细胞的增殖具有明显的促进作用，说明在 ＢＭＰ４中加入 ＩｇＧ － Ｆｃ 形成二聚体后可以更好地发挥生理活性。

转自：“科研人直通车”微信公众号

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