我国学者开发新冠病毒核衣壳蛋白比率荧光免疫分析新方法

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我国学者开发新冠病毒核衣壳蛋白比率荧光免疫分析新方法

近日，中科院深圳先进院马英新和南方科技大学第二附属医院刘映霞团队合作，在Nano Research 期刊发表了新的研究论文，在该研究中，马英新和刘映霞团队采用合成前修饰方法制备了新型比率荧光探针Si-FITC NPs，该方法无需合成后化学修饰过程，提高了探针的发光效率和稳定性。

Si-FITC NPs的同步荧光光谱中有两个明显的荧光峰，一个是位于381 nm的Si荧光峰，另一个是在489 nm处的FITC荧光峰。碱性磷酸酶（ALP）是一种重要的水解酶，普遍存在于哺乳动物的体液和组织中，它可以通过去磷酸化过程去除核酸、蛋白质等生物分子中的磷酸基团。本研究利用ALP催化对硝基苯基磷酸盐（pNPP）水解为对硝基苯基（pNP）及pNP对比率荧光探针Si-FITC NPs中Si的内滤效应（IFE），实现了对Si-FITC NPs对ALP的特异性猝灭响应。

在本检测体系中，Si-FITC NPs双峰荧光强度比值的变化与ALP活性呈正相关。ALP作为ELISA中广泛使用的标记酶，可以介导用于SARS-CoV-2 N蛋白的检测，且结果显示该检测方法比商品化试剂盒灵敏度高1个数量级。同时，将该新型ELISA方法应用于人血清中SARS-CoV-2 N蛋白检测。在血清回收实验中，其回收率为95.17-107.41%，表明该方法具有一定的应用潜力。

此外，将该方法用于了SARS-CoV-2病毒感染的临床样本分析，结果显示该方法能准确地检测出SARS-CoV-2的阳性样本和阴性样本，可为SARS-CoV-2病毒感染的早期筛查提供有效的方法指导。该方法不仅提高了ELISA的检测灵敏度，而且拓宽了基于内滤效应的比率型传感器的应用范围。

研究团队采用一锅水热法制备比率荧光探针Si-FITC NPs，该方法将APTES与FITC偶联，与APTES共作为Si源，避免了合成后修饰，提升了探针的发光效率与稳定性。在ALP介导的比率荧光ELISA传感体系中，通过形成固定化ALP的免疫复合物，可将SARS-CoV-2 N蛋白含量转化为检测体系内ALP含量。

研究团队使用350 V氙气灯对Si-FITC NPs连续辐射两小时并监测其荧光强度变化以评估Si-FITC NPs的光稳定性。结果表明，由于Si涂层的保护，Si-FITC NPs中的Si和FITC都具有更好的光稳定性。Si-FITC NPs在不同的Tris缓冲液pH条件下双峰的荧光强度比没有明显变化。团队还研究了体液中一些常见离子和生物分子对Si-FITC NPs荧光的影响。这些干扰物质（100 μM）对Si-FITC NPs的荧光基本没有影响，证实Si-FITC NPs具有强的抗干扰能力。以上数据表明Si-FITC NPs具有良好的光稳定性、pH稳定性及化学稳定性。

研究团队考察了ALP对Si-FITC NPs探针特异性猝灭的性能。结果显示，随着ALP浓度从0 U/L增加到200 U/L, Si-FITC NPs在389 nm处的荧光被明显猝灭，而481 nm处的荧光没有明显变化。表明可通过比率荧光的方法检测体系中的ALP浓度。当ALP浓度处于0.5–20.0 U/L的范围中时，可以观察到Si-FITC NPs探针的双峰荧光强度比的差值（Δ(F389/F481)）与ALP浓度之间有良好的线性关系。ALP作为ELISA中广泛使用的标记酶，在检测体系中可以介导ELISA用于SARS-CoV-2 N蛋白的免疫分析。

基于以上实验数据，该团队将ALP对Si-FITC NPs探针特异性猝灭的特性与ELISA体系结合用于SARS-CoV-2 N蛋白检测。团队先后优化了ELISA体系中pNPP的浓度和SA-ALP的稀释度，提高了检测方法的灵敏度。在最优条件下，Si-FITC NPs探针中Si荧光随着N蛋白浓度的增加而逐渐被猝灭，Si-FITC NPs的荧光变化Δ(F389/F481)与N蛋白浓度的对数（0.01~10.0 ng/mL和50~300 ng/mL）之间有良好的线性关系，该传感体系对N蛋白的检出限为0.002 ng/mL，比商品化试剂盒的灵敏度（LOD为0.037 ng/mL）高一个数量级。

研究团队收集了COVID-19患者和非COVID-19患者的口咽或鼻咽拭子样本，将本研究构建的比率荧光ELISA用于临床样本分析，并与实时定量PCR的结果进行比对。如图5所示，阳性样本的荧光强度比的变化远大于阴性样品，且阴性样本信号低于检出限，表明该比率荧光ELISA方法能够有效区分COVID-19患者和非COVID-19患者的样本，具有一定的临床应用价值。

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孙兵/谢幼华/徐建青/陆路/丁建平/凌志洋揭示冠状病毒广谱中和抗体新机制

6月30日，上海交通大学，中国科学院，复旦大学等多单位合作，孙兵、谢幼华、徐建青、陆路、丁建平与凌志洋共同通讯在Nature Microbiology （IF=31）在线发表研究论文，该研究从一名 COVID-19 恢复期患者中分离出一种名为 76E1 的人类抗体，并报告说它对多种 α 和 β 冠状病毒（包括 SARS-CoV-2 变体）具有广泛的中和活性。76E1 还结合来自 γ- 和 δ- 冠状病毒的肽中的表位。76E1 在预防性和治疗性鼠类动物模型中交叉保护免受 SARS-CoV-2 和 HCoV-OC43 感染。

根据抗原和遗传标准，冠状病毒分为四个属：α-、β-、γ-和δ-冠状病毒。三大高致病性冠状病毒对公众健康造成了威胁：2002-2003 年的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）、2012 年的中东呼吸系统综合症冠状病毒（MERS-CoV）和2019 年出现的 SARS-CoV-2。由 SARS-CoV-2 引起的 COVID-19 大流行对世界经济和全球健康产生了深远的影响。此外，包括β-冠状病毒HCoV-OC43、HCoV-HKU1和远缘α-冠状病毒HCoV-229E和HCoV-NL63在内的几种常见的流行性人类冠状病毒每年都在传播并引起轻度或中度上呼吸道疾病。冠状病毒对人类的反复溢出事件凸显了开发广泛的治疗和预防措施的必要性。

目前的一个研究重点是 SARS-CoV-2 在传播过程中的突变。在刺突 (S) 蛋白中发现了一系列突变体，这些突变体可能会削弱基于原始 SARS-CoV-2 设计的疫苗或抗体的保护活性。耐药变体的鉴定表明当前疫苗和抗体的应用存在潜在风险。

大多数针对 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和 MERS-CoV 的中和抗体靶向 S1 的受体结合域 (RBD)，从而阻断病毒与靶细胞的附着。然而，RBD 抗体通常是病毒特异性的，并构成选择压力，导致新变体的迅速出现。然而，只有少数 RBD 抗体显示出狭窄的交叉反应性，这仅限于 β-冠状病毒属。已发现靶向病毒表面蛋白保守功能域的广泛中和抗体 (bnAbs) 可预防全球流行病毒，如甲型流感病毒 (IAV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 和人类免疫缺陷病毒 (HIV)。

在多种冠状病毒中，S2 亚基比 S1 亚基更保守。S2 抗体（B6 和 S2P6）显示出与 β-冠状病毒的交叉反应性，但未显示与 α-冠状病毒的交叉反应性，正如通过靶向保守的茎螺旋区域所报道的那样，防止 S2 亚基从融合前状态重新折叠到融合后状态，通过抑制膜融合从而阻止病毒进入。

在这里，该研究报告了一种人类抗体 76E1，它对来自 α-和 β-冠状病毒的代表性病毒株具有交叉中和作用，甚至对含有来自 γ-和 δ-冠状病毒属的抗体表位的肽具有交叉结合活性。该抗体在小鼠中显示出针对 SARS-CoV-2 和系统发育遥远的 HCoV-OC43 的交叉保护作用。

结构和功能分析表明，76E1识别的表位，包括融合肽和S2'位点，在α-、β-、γ-和δ-冠状病毒中高度保守。识别模式也很有趣，因为表位部分隐藏在融合前 S 三聚体的结构中，但可能在受体结合过程中暴露。76E1 可能通过阻断 S2' 切割来抑制膜融合。保守表位的鉴定将指导针对当前和未来新出现的 SARS-CoV-2 变体和其他冠状病毒属的泛冠状病毒疫苗和抗病毒药物的设计。

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Nature Medicine：这个群体接种疫苗不能预防新冠后遗症

Long COVID，也被称为COVID-19长期后遗症，通常是指COVID-19后遗症症状持续时间超过三个月。对此的研究滞后于急性感染期的研究。

Nature Medicine发表了由美国VA医药系统（US Department of Veterans Affairs）领衔的疫苗突破性感染后的Long COVID研究。这也是当前入组规模最大的一项Long COVID研究。VA医院系统隶属于美国联邦政府VA部，是美国唯一一个政府运营的医疗机构，也是美国最大的医疗机构。

在这项研究中，研究人员利用美国退伍军人事务部的国家医疗保健数据库招募了一个由33940位BTI患者组成的队列，并保持随访6个月，其他3个对照组为几个当前未感染新冠的队列，分别为当前组 ( n= 4983491)、历史组 ( n= 5785273) 和接种疫苗控制组( n = 2566369) 。研究人员发现：

与接种过疫苗同时尚未感染的当前对照组群体相比，在感染病毒6个月后，BTI人群在疾病发生的前30天内，表现出更高的死亡风险（HR = 1.75, 95% CI: 1.59, 1.93）和偶发急性后遗症的出现率，如心血管、凝血和血液学、胃肠道、肾脏、心理健康、代谢、肌肉骨骼和神经系统等疾病 (HR = 1.50, 95% CI: 1.46, 1.54)。与历史组和接种疫苗控制组相比，上述结果仍保持一致； 与之前未接种过疫苗的新冠感染者相比，接种过疫苗的BTI患者的死亡风险（HR = 0.66, 95% CI: 0.58, 0.74)和急性后遗症出现率（HR = 0.85, 95% CI: 0.82, 0.89）都显示降低；这与之前的研究结论一致。

总之，研究结果表明，在感染前接种疫苗只能在疾病的急性后期提供部分保护，在前期的保护效力甚微。因此，将其作为唯一的缓解策略可能无法最佳地减少感染新冠的长期健康后果。研究结果强调接种疫苗可以降低出现后遗症的几率，但不能完全消除其发生，认为继续优化BTI一级预防策略十分必要。

转自：“科研之友 ScholarMate”微信公众号

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