很多老师在进行细胞培养实验时，细胞总是会莫名其妙的就被污染了，同样的实验人员，同样的环境，同样的培养体系，可是细胞还是有污染。
试剂、耗材已经使用控制变量法进行过排查，那么还有什么方面可能会导致污染呢？
———— 细胞房环境污染
（空气中的沉降菌）
Vol.1
有关沉降菌的术语与定义
沉降菌
通过使用专门的培养基，并按照以下标准提及的方法，收集空气中的活微生物粒子，在适宜的条件下，繁殖到肉眼可见的菌落数。通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
沉降菌菌落数
规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以个/皿表示。
静态a
洁净室（区）在净化空气调节系统已安装完毕且功能完备的情况下，生产工艺设备已安装、洁净室（区）内没有生产人员的状态。
静态b
洁净室（区）在生产操作全部结束，生产操作人员撤离现场并经过20min 自净后。
动态
洁净室（区）已处于正常生产状态，设备在指定的方式下进行，并且有指定的人员按照规范操作。
标准：
1. GB/T 16292-2010 《医药工业洁净室（区）》悬浮粒子的测试方法》
2. GB/T 16294-2010 《医药工业洁净室（区）》沉降菌的测试方法》
Vol.2
如何进行检测
1. 实验准备
试剂：大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）
仪器：恒温培养箱（需定期对培养箱进行校验，最好每年一次）
检测目标：生物安全柜、细胞房、开放环境、人手指等
2. 采样点数目及布置
最少采样点数：
注：常规超净台或安全柜洁净度级别：100级；常规细胞房洁净度级别：10000级
布置要求：
采样点布置宜力求均匀，避免采样点在局部区域过于稀疏；细胞房、安全柜、超净台建议下列布置图：
参照医药工业洁净室沉降菌的测试方法细胞房、安全柜、超净台建议布置图中，我们选取五点取样法。（大家可根据实验室情况进行选择，具体没有规定限制取样布置图）
最小培养皿数：
注：常规超净台或安全柜洁净度级别：100级；常规细胞房洁净度级别：10000级；这里的最小培养皿数是所有采样点皿数总和。
3. 生物安全柜、细胞房及开放环境测试步骤
生物安全柜
① 选择状态：
静态a测试时：生物安全柜应开机运行不少于10min；细胞房净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始。
静态b测试时：生物安全柜宜在操作人员撤离现场并经过10min自净后开始；细胞房宜在操作人员撤离现场并经过20min自净后开始。
动态测试：则须记录生产开始的时间以及测试时间。
② 培养皿表面必须严格消毒，将培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个打开培养皿盖（避免人衣物上微生物的掉落干扰实验），使培养基表面暴露在空气中。
静态测试时，培养皿暴露时间在30min以上，室内测试人员不得多于2人。
动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4h。
细胞房
③ 若细胞房的房型及器材摆放并不适合采用标准的五点取样法。因此可以选取较容易污染的点进行测试
桌面
离心机
显微镜
培养箱
传递窗
注：可向右滑动
开放环境
④ 全部采样结束后，收样时需从外到里逐个盖上培养皿盖（同样避免人衣物上微生物的掉落干扰实验），做好相应标记后将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养，培养时间不少于48h。
⑤ 每批培养基应有对照试验，检查培养基本身是否污染。可选定每批3只培养皿不打开作对照培养。
4. 阳性对照测试
为避免无阳性对照，我们邀请技术同事将手指点涂在培养基上进行阳性对照实验。
两天后可明显观察到菌落的生成。
肉眼可以观察到明显的菌落形成，成片的是菌落重叠生长聚集在了一起，很难分辨出具体有多少个菌落。
※ 平时我们的手上会携带大量的菌
Vol.3
测试结果判定
可直接观察：
由图可以看出对照组都未长菌。
可以看出生物安全柜无污染。
由图可以看出我公司细胞房内洁净程度达标，无污染
开放环境下，肉眼可以看到有菌落形成
菌落计数：
用肉眼对培养基上的所有菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
平均菌落的计算，如下：
M为平均菌落数；M1为1号培养皿菌落数
Mn为n号培养皿菌落数；n为培养皿
结果评定：
计算后需要对结果进行评定，不同国家对不同洁净度级别规定的平均菌落数不同。
注：a为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示
常规超净台或安全柜洁净度级别：100级；常规细胞房洁净度级别：10000级
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注意事项及监测频率
注意事项：
★ 测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性
★ 采取一切措施防止人为对样本的污染。
★ 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
★ 由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
★ 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
★ 沉降菌检测使用的大豆酪蛋白琼脂培养基不一定适养支原体，所以不代表无支原体污染。
监测频率：
监测频率：
★ 如果生物安全柜所处的环境为十万级洁净区，可每三个月测试一次;
★ 如果生物安全柜所处的环境为万级洁净区，至少每个月监测一次沉降菌;
★ 如果沉降菌连续几次监测不合格，则考虑更换生物安全柜的高效过滤器。
转自：医学科研小坑
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