为了理解发育和疾病发生机制，研究人员需要揭示复杂的多细胞组织的结构以及细胞内的分子表达情况。常用的转录组学研究方法会将组织均质化并分析组织细胞中 mRNA 的平均基因表达。但生物体的内环境相对复杂，这一研究过程会不可避免的丢失组织中细胞所处的原始位置信息，也导致了细胞间的通讯网络被打破，这使我们难以获得组织中不同区域的细胞构成和基因表达状态，以及不同功能区之间的基因差异表达等信息。
新的空间转录组方法不仅带来转录组信息，同时还提供空间信息，帮助研究者更好辨别转录的位置，有助于更好的理解人类的生理状态，发育调节以及疾病形成原因。其以强大的原位、高通量和精准的空间遗传表达信息表征能力逐渐成为生命科学领域的大热门领域之一。从 2020 年到 2022 年，空间转录组学相关技术连续三年被 Nature Methods 评为年度技术。那么，对于这样一个热门技术，实际该如何运用呢？
今天，Illumina 为大家解析从组织切片绘制完整转录组，同时保留形态学背景的空间转录组学具体应用：
从组织切片绘制完整转录组，同时保留形态学背景的方案
根据您的样本类型（新鲜冷冻或 FFPE）选择合适的 Visium 空间基因表达实验方案。可在 10x Genomics 支持中心网站上获得 Visium 样本制备的演示方案[1,2]。使用标准技术对放置在 Visium 玻片上的组织切片进行苏木精-伊红（H&E）或免疫荧光染色。使用显微镜对染色组织切片进行成像。成功的基因表达可视化高度依赖于良好的染色和成像实践[3]。
对组织切片成像后，可使用 Visium 空间基因表达试剂盒捕获新鲜冷冻或 FFPE 组织的转录本。Visium 空间基因表达玻片有四个正方形区域或捕获区域，每个玻片最多可运行四个组织切片*。每个捕获区域有数千个条形码位点，包含数百万个捕获寡核苷酸，每个位点都有唯一的空间条形码。
* 在文库制备期间，每个捕获区域还会获得一个样本条形码，以便在一次测序运行中，可以混合来自不同捕获区域的多个文库。其他 Visium 玻片的每张玻片有两个或八个捕获区域。
依照空间组学的测序需求，建议在 NovaSeq™ 6,000、NextSeq™ 2,000、NextSeq™ 1,000 或 NextSeq™ 550 系统上对 Visium 空间基因表达文库进行测序（表 1）。小规模仪器，如 iSeq™ 100 系统可用于文库质量控制[4]。
Visium 空间基因表达文库包含标准的 Illumina 双端构建体， 两侧为 i5 和 i7 标签，这些标签是 Illumina 流动槽结合所必需的（表 2，图 3）。Read 1 引物用于测序 16 bp 的空间条形码和长达 12 bp 的唯一分子标记（UMI）。Read 2 引物用于测序 cDNA，或连接探针、插入片段。两个 10 bp 样本标签在 i5 和 i7 read 中进行测序[5]。
Visium 文库的建议测序深度取决于几个因素，包括组织复杂性、组织覆盖度和实验目的。空间基因表达文库需要通过双端测序运行进行测序。（更多详细信息，请查阅文末技术说明详解）
在 Visium 工作流程中，捕获两种主要数据类型：组织图像和 BCL 或 FASTQ 格式的测序数据。Space Ranger 分析流程使用这两种数据输入将 Visium 测序数据与图像比对。根据相关的空间条形码，将捕获的检测到的每个基因转录本分配至组织图像上的空间位置。数据处理后，您可以使用 Loupe Browser 可视化软件轻松查询空间基因表达数据的不同视图。Loupe Browser 允许您研究重要的基因、表征和分析簇，并进行差异表达分析。或者，您可以使用第三方工具进一步处理数据。
空间转录组学分析能够在新鲜冷冻组织（图 4）[6]或 FFPE 样本（图 5）的组织环境中对基因表达进行高分辨率表征[7]。
技术的进步使得新的 NGS 方法能够继续为复杂的生物系统提供见解。然而，对分离组织进行的分析丢失了体内存在的关键空间信息。空间转录组学技术的应用，可以提供高多重性的空间分析，以及基因和蛋白质分析所需的组织结构信息。
对以上研究有进一步了解需求，可以通过扫码下载技术说明，获取相关实验方案的详细内容：
内容策划：康晋伟
项目审核：邵澜媛
题图来源：图虫创意
参考文献：
[1]. 10x Genomics. Visium Spatial Protocols – Tissue Preparation Guide. support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/ sample-prep/doc/demonstrated-protocol-visium-spatial- protocols-tissue-preparation-guide. Accessed June 3, 2021.
[2]. 10x Genomics. Spatial Gene Expression for FFPE Support. support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression-ffpe/. Accessed June 14, 2021.
[3]. 10xGenomics. Visium Spatial Gene Expression Imaging Guide-lines. support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/ index/ doc/technical-note-visium-spatial-gene-expression- imaging- guidelines. Accessed June 3, 2021.
[4]. Illumina.QC and rebalancing of single-cell gene expression libraries using the iSeq 100 System. illumina.com/content/ dam/ illumina-marketing/documents/systems/iseq/single- cell-library- qc-app-note-770-2019-029.PDF. Published 2020. Accessed June 3, 2021.
[5]. 10xGenomics.SequencingMetrics&BaseCompositionof Visium Spatial Gene Expression Libraries. support.10xgenomics. com/spatial-gene-expression/sequencing /doc/technical-note- sequencing-metrics-and-base-composition-of-visium- spatial- gene-expression-libraries. Accessed June 3, 2021.
[6]. 10xGenomics.Visualize gene expression within the tissue context.
[7]. 10xGenomics. Spatial biology without limits: Spatially resolve gene expression in FFPE samples. pages.10xgenomics.com/ rs/446-PBO-704/images/10x_LIT000128_PS_Spatial_biology_without_limits_Spatial_gene_expression_in_FFPE.pdf. Accessed June 3, 2021.
