Nucleic Acids Res | 西湖大学马丽佳团队开发了一种新的库内连接策略来促进多重 CRISPR筛选

编者按

同时靶向多个基因是 CRISPR基因组编辑的一大优势，但在 CRISPR 筛选中难以实现。基因或基因产物之间的串扰是确保细胞稳定性和功能多样性的一种常见且基本的机制。然而，仍然缺乏将更多基因组合映射到有趣表型的筛选方法。

2022年6月7日，西湖大学马丽佳团队在Nucleic Acids Research （IF=17）在线发表题为“An in-library ligation strategy and its application in CRISPR/Cas9 screening of high-order gRNA combinations”的研究论文，该研究开发了一种通用的库内连接策略，并将其应用于生成多路复用 CRISPR 库，该库可以干扰细胞中的四个预先设计的靶标。

该研究对诱导抗肿瘤免疫反应的潜在指导 RNA (gRNA) 组合进行了体内 CRISPR 筛选。同时干扰 CD8+ T 细胞中三个检查点的组合被证明比仅干扰 Pdcd1 对肿瘤环境中的 T 细胞激活更有效。总之，该研究开发了一种新的库内连接策略来促进多重 CRISPR 筛选，这可以扩展我们探索协调基因行为的组合结果的能力。

CRISPR 介导的基因筛选是剖析导致特定表型的功能单元的有力工具。干扰单靶向基因的应用在各种研究中揭示了重要的生物学见解。另外，同时干扰多个靶标在识别高阶基因相互作用结果的目标方面具有独特的优势。然而，这一方向的探索仍然受到技术挑战的阻碍。

基因的协同行为广泛存在于细胞中。在许多情况下，干扰单个基因不足以出现感兴趣的表型，即使单个基因剂量有助于表型。例如，多组转录因子相互串扰以协调癌症进展中的侵袭-转移级联反应；抑制剂或阻断抗体的组合使用已被证明在针对许多癌症类型的免疫治疗中更有效；不止一种受体参与病毒的细胞侵袭，因此阻断单一受体不足以保护宿主细胞免受感染。

最近，已经建立了一些方法来通过干扰多个靶标来实现组合遗传筛选。例如，随机组装 gRNA 对以识别影响卵巢细胞生长的基因相互作用，并探索对应于杀死 K562 白血病细胞的药物对。为了筛选预先设计的对，人们可以利用高通量寡核苷酸合成平台，这可以促进将 2-3 个 gRNA 表达盒作为单个寡核苷酸直接合成。此外，对于 gRNA 的更多组合，gRNA 表达盒必须在库中以受控方式组装，以便筛选预先设计的组合。

理论上，较长的寡核苷酸合成仍然是可能的，但错误率和成本随着长度的增加而迅速增加，使其不优选和不实用。或者，用于 Cpf1 编辑的 crRNA (CRISPR RNA) 具有单元长度较短的优点，并且可以通过适当的设计将多达三个单元装入单个寡核苷酸序列中。然而，其 PAM 序列的有限选择，特别是在具有高 GC 含量的启动子区域周围，限制了它成为更多组合遗传筛选的通用解决方案。在这里，该研究开发了一种库内连接方法，可以准确地将数千个序列与其特定对应物连接起来。该研究通过制备 4gRNA-combo（四种 gRNA 的组合）文库展示了库内连接策略，该文库同时干扰了单个细胞中的四个预先设计的靶标。此外，基于这种类型的文库进行了一次体外和一次体内 CRISPR 筛选。4gRNA 组合文库有助于发现在高通量方面具有挑战性的高阶基因协调。这项研究提供了一种通用策略，可以从一个载体中表达多个预先设计的 gRNA。该策略为应用 CRISPR/Cas9 筛选以促进对基因组合的可扩展和可编程干扰开辟了一条新途径。

参考消息：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac458/6603654

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