牛津大学重磅综述: 造血干细胞基因治疗的免疫屏障

背景：

    使用造血干细胞(HSCs)的细胞和基因治疗集中体现了再生医学的变革潜力。最近的临床成功的基因治疗包括自体造血干细胞移植(HSCT)，表明基因工程在这种干细胞类型的治疗疾病的潜力。随着CRISPR基因编辑技术、造血干细胞体外扩增方法和非基因毒性调节方法的最新进展，以造血干细胞为基础的基因治疗的临床适应症范围预计将显著扩大。然而，大量的免疫挑战需要克服。这些包括对基因治疗试剂的预先免疫，对通过基因工程引入到造血干细胞中的新抗原的免疫反应，以及与下一代和现成造血干细胞产品相关的独特挑战。

简介：

2022年3月17日，来自英国牛津大学威瑟罗尔分子医学研究所的Adam C. Wilkinson教授课题组在Nat RevImmunol（IF: 53.1）杂志上发表题为“Immunological barriers to haematopoietic stem cell gene therapy”的综述[1]。通过在本综述中综合这些因素，作者希望鼓励更多的研究来解决当前和下一代基于造血干细胞的基因治疗相关的免疫学问题，以帮助实现这一领域的全部潜力。

主要结果：

一类罕见的骨髓细胞被称为造血干细胞(HSCs)，负责支持血液和免疫系统的终生稳态。HSCs通过其独特的自我更新和多能分化能力实现这一点。因此，HSCs的基因突变(遗传或体细胞)表现在广泛的疾病表型中，其中一些直接影响HSCs的功能，但大多数影响其分化的后代。因此，由于HSCs的突变是许多遗传性血液病的根本原因，对HSCs中这些致病突变的纠正是可以治愈的。

对基因治疗试剂的免疫。

开发有效的基因操纵HSCs的工具必须考虑先天免疫系统的细胞内信号通路和适应性免疫系统的反应。在体外基因治疗方法中，HSCs内的先天免疫信号通路是有效基因矫正的主要障碍；然而，随着该领域接近实现体内HSC基因治疗，对基因治疗试剂的适应性免疫反应也必须考虑。

对慢病毒的先天免疫。HSCs表达多种模式识别受体(PRRs)，通过感知与病原体相关的保守分子模式或与损伤相关的分子模式，分别对外来病原体或内源性损伤进行检测和应答。这些PRRs包括在细胞膜、核内体和溶酶体中感知外来分子的Toll样受体(TLRs)，检测外来RNA的视黄酸诱导基因I (RIG-I)样受体(RLRs)，以及检测外来DNA的cgas sTiNg途径等DNA传感器。因此，任何基因治疗试剂的设计和交付给HSCs的方式都必须尽量减少PRR-介导的信号通路的激活。

对基因编辑酶的先天免疫。与以慢病毒为基础的基因疗法(利用病毒的自然生命周期进入细胞并对其进行基因工程)不同，基因编辑需要向HSCs中引入无法自然渗透的试剂。电穿孔法是一种将外源基因编辑试剂引入HSCs的简单方法。DNA载体通常用于基因工程细胞系，但其在原代细胞中的使用导致了胞质dsDNA激活PRR通路，如cGAS-STING通路。为了避免在HSCs中激活DNA传感通路，目前的基因编辑方法避免了DNA成分，而在基于CRISPR的平台(Cas9蛋白与合成的单向导RNA (sgRNA)复合物)的情况下，依赖于RNA、蛋白质或核糖核蛋白复合物的传递。然而，这些试剂的合成或异种来源可导致HSCs中PRR-介导的信号通路的激活。

对DNA供体的先天免疫。与传递基因编辑酶相比，传递DNA供体来刺激HSCs的同源性定向修复被证明是一个更大的免疫挑战，因为裸露的dsDNA片段可以触发HSCs的cGAS-STING途径等PRR途径，从而导致细胞死亡。因此，人们研究了提供DNA供体模板的替代方法，主要集中在病毒载体上，因为它们已经进化到逃避细胞内固有免疫反应。临床相关水平的同源性定向修复首先通过使用非整合慢病毒载体实现，随后通过使用腺相关病毒(AAV)载体实现。在造血干细胞中，AAV6已被证明对刺激同源性直接修复特别有效，使用AAV6纠正镰状细胞病患者血红蛋白β(HBB)基因突变的临床试验（ClinicalTrials.gov NCT04819841）预计将于今年晚些时候开始。

图1：造血干细胞基因治疗

对HSC肿瘤抗原的免疫。

    即使基因工程试剂可以应用于HSCs而不引发对其的免疫应答，修饰后的HSCs的成功移植和/或在体内存活对成功的基因治疗提出了免疫挑战。通过纠正引起疾病的突变或引入转基因的治疗，对HSCs基因组进行修饰，可导致肿瘤抗原的表达，这将带来针对基因工程细胞的适应性免疫反应和将其从体内清除的风险。作为基因治疗的一部分，引入肿瘤抗原以诱导针对基因工程细胞的适应性免疫反应的潜力已在HSCs和其他器官系统的大量临床前研究中得到证实，以及在临床研究中(尽管尚未在HSC为基础的临床试验中)。然而，HSC基因治疗的一个独特方面是，在造血干细胞移植之前可以进行淋巴消除，以促进通过基因治疗引入的肿瘤抗原的耐受;在这种情况下，移植的HSCs重建的免疫系统在体内对自身抗原(包括肿瘤抗原)的反应性进行了阴性选择，以确保中枢耐受。

图2：造血干细胞移植和基因治疗的重要里程碑

对下一代疗法的免疫。

    已经成功地HSC基因治疗临床治疗多种疾病，现在可以设想新的方式，HSCs的基因工程可能超出纠正严重的威胁生命的突变。一个具有特殊潜力的领域是将新的免疫功能引入造血系统。例如，目前正在进行的工作是通过敲除HSC基因组中的CCR5 (HIV-1的共同受体)和引入限制因子，来使用HSC基因治疗，使其对HIV-1感染产生抗性。小干扰RNAs或CRISPR-Cas13系统(直接抑制病毒生命周期或抑制参与HIV-1复制的基因)。随着这些方法变得更加完善，它们的应用可能扩大到其他主要疾病负担原因的感染，如爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒或疟疾。HSC基因治疗也被认为是一种提高嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗白血病安全性的方法。通过敲除供体造血干细胞中CAR-T细胞靶向的抗原(如CD33)，可以防止CAR-T细胞对供体造血干细胞的不必要的消除。

图3：造血干细胞基因治疗的基因工程平台

造血干细胞的体内基因治疗。

    作为将经过基因编辑的HSCs移植到患者体内的替代方法，有可能在体内对HSCs进行基因工程改造。体内HSCs基因治疗将避免造血干细胞分离、编辑和造血干细胞移植的需要，并可能彻底改变我们治疗和治愈血液病的方式。虽然体内基因治疗已经很成熟地针对其他器官系统，如肝脏、肌肉和眼睛，但由于体外HSCs基因治疗方案的存在，其在HSCs上的应用相对不发达;因此，我们拥有的关于潜在免疫并发症的最好证据来自于这些其他系统。目前，体内基因治疗主要有两种方法:利用病毒载体在体内表达所需基因或基因编辑试剂;或将包裹在纳米颗粒中的mRNA或蛋白质传递到体内细胞中，将基因编辑试剂引入细胞中。

图4：造血干细胞基因治疗中的免疫屏障

结论和展望：

这是HSC基因治疗领域的一个激动人心的时代。近年来的临床成功突出了HSC基因治疗在疾病治疗中的转化潜力。随着高效HSC基因治疗技术挑战的解决，下一代HSC基因治疗的实施也面临着新的挑战。目前的体外自体HSC基因治疗模式个性化程度高，技术难度大，因此HSC基因治疗非常昂贵。用于β-地中海贫血的betibeglogene autotemcel(商标名Zynteglo)基因疗法就是一个很好的例子。尽管该疗法获得了临床批准，但由于每位患者180万美元的成本，该疗法已被撤出欧洲市场。

随着HSC基因治疗领域的发展，先天免疫和适应性免疫都提出了挑战。这些挑战必须克服，以应用当前和下一代HSC基因治疗成功和安全。我们相信，在不久的将来，HSC基因治疗的进展将取决于我们应对这些免疫挑战的能力。适应性免疫系统尤其对下一代的HSC基因治疗提出了一个重大挑战，因为它可能导致移植入HSCs的肿瘤抗原、在体内交付给HSCs的基因工程试剂或现成的异基因HSCs的排斥反应。造血系统是独特的，淋巴消除提供了一个潜在的途径来解决大多数这些挑战;然而，淋巴消除在患者健康方面有显著的缺陷，也应该寻求其他途径来解决这些挑战。一些潜在的免疫系统对新抗原耐受的解决方案是工程细胞变得低免疫，以及使用HSC来源的APCs来耐受免疫系统。然而，这些策略都没有经过临床测试，需要更多的研究将这些方法纳入HSC基因治疗的一部分。通过在本综述中综合这些免疫学挑战，我们希望鼓励更多的免疫学家研究和解决当前和下一代HSC基因治疗中的免疫学问题，以实现这一方法在改善人类健康方面的全部潜力。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41577-022-00698-0

参考文献：

[1] Charlesworth CT, Hsu I, Wilkinson AC, Nakauchi H. Immunological barriers to haematopoietic stem cell gene therapy. Nat Rev Immunol. 2022 Mar 17:1–15. doi: 10.1038/s41577-022-00698-0. Epub ahead of print. PMID: 35301483; PMCID: PMC8929255.

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