20分钟出结果！武汉大学中南医院团队合作研发出一种新冠病毒快检新方法

20分钟出结果！武汉大学中南医院团队合作研发出一种新冠病毒快检新方法

Nature Biomedical Engineering在线发表武汉大学医学研究院、中南医院医学研究院、教育部免疫与代谢前沿科学中心殷昊教授与张楹教授课题组在新冠病毒核酸检测领域的最新成果：课题组开发出了一种高灵敏度、高特异性、操作便捷且快速的核酸检测方法。

新冠病毒（SARS-CoV-2）在全球范围内大肆传播，新冠变异株的流行使疫情防控更具挑战。快速筛查是控制疫情传播最有效的手段。RT-qPCR是目前新冠病毒的检测金标准。该方法特异性强、灵敏度高, 但是由于其依赖实验室专业仪器和专业人员操作，存在耗时长等问题（从采样到出结果大致需要6小时），难以应对病毒惊人的传播速度。因此，亟须研发一种新的快速核酸检测方法。

课题组首次靶向非经典PAM建立了兼具快速（15-20分钟）、灵敏（和qPCR相当）、稳定和特异的核酸检测一步法（sPAMC），并在SARS-CoV-2真实样本中达到94.2%准确度并无一例假阳性。sPAMC技术仅需20分钟就能检测到Ct值为35.8的新冠真实样品，并且用便携式紫外灯或蓝光灯照射即可观察到结果。

CRISPR/Cas系统不仅用于基因编辑，也被研发为核酸检测工具。Cas12和Cas13特异性切割双链DNA底物（顺式切割）后，会激活其非特异性切割单链DNA或RNA的能力（反式切割）1-5。CRISPR特异性由两部分共同决定，一部分是crRNA和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas蛋白复合体和位于靶DNA旁的短序列形成非共价结合，后者被称为PAM (Protospacer Adjacent Motif)。当Cas12搜寻到底物上的PAM序列，在crRNA和靶DNA碱基配对之后，进而特异性切割dsDNA，随后激活其反式切割能力，快速降解单链DNA报告系统，释放出的荧光信号。新冠病毒检测的两步法（SHERLOCK和DETECTR）先通过等温扩增富集待检的核酸片段，再加入CRISPR/Cas切割体系产生信号。虽然两步法兼具高特异性、高灵敏度等优点，却增加了操作复杂度和引入交叉污染等问题6,7。STOPCovid是在两步法基础上优化出的一步检测法，即在一个反应试管中同时进行样品扩增和切割反应，虽然简化了操作步骤并降低交叉污染风险，但灵敏度显著低于两步法，且需要约45分钟至1小时左右的反应时间8,9。

课题组将非经典PAM介导的一步法检测技术命名为sPAMC ，并将sPAMC应用到SARS-CoV-2真实样品检测。研究者们共检测了204个咽拭子样本，在104个RT-qPCR阳性样本中，sPAMC 能检出98个，剩余的100个阴性样本均未检出，证明了sPAMC 有94.2%的检出率且无假阳性。sPAMC技术仅需20分钟就能检测到Ct值为35.8的新冠真实样品，并且仅用便携式紫外灯或蓝光灯照射即可观察到结果。

非经典PAM的快检方法sPAMC 相比于传统一步法有如下优点：1）检测速度提高2-3倍，可以实现在10-15分钟内检测出DNA病毒，15-20分钟内检测出RNA病毒；2）荧光信号结果在样本间的可重复性高，荧光信号波动少于30%；3）检测灵敏度提高，与qPCR一致; 4) 极大地拓宽了靶向的检测位点可选择性，可选择的非经典PAM组合为经典PAM的7倍以上。研究者首次提出了通过靶向非经典PAM，降低Cas12a的顺式和反式切割速率的方法来实现核酸检测，为开发建立更快更灵敏的CRISPR核酸检测方法提供了新思路。

课题组致力于研发能满足快速简便、灵敏特异的一步法核酸检测新方法。通过比较新冠病毒序列中四个位点的非经典PAM (VTTV,TVTV, VTTV) 和经典PAM (TTTV) 的反式切割活力和一步法效率，发现和经典PAM相比，非经典PAM显著加快检测速度，将灵敏度提高了10-100倍，大幅度提升信号的稳定性。进一步探索机制发现：在一步法反应中，等温扩增和CRISPR检测存在竞争关系。当Cas12a遇到经典PAM时，由于切割能力过强，等温反应扩增出来的目的片段被快速消耗，难以达到指数扩增，导致底物无法有效富集，荧光信号延迟产生且不稳定；而对于非经典PAM介导的一步法，Cas12a和底物的结合能力弱。在反应初期，等温扩增占据主导地位，快速富集足够的底物，为反应后期Cas12a切割和荧光释放奠定前期基础。

出版信息

标题:

Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs for Cas12a

出版信息:

Nature Biomedical Engineering，21 March 2022

DOI:

10.1038/s41551-022-00861-x

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SARS-CoV-2免疫病理学的关键调控因子

浙江大学研究者们在“Signal Transduction and Targeted Therapy”杂志上发表了题为“STING, a critical contributor to SARS-CoV-2 immunopathology”的评论性文章，本文对环状GMP-AMP合成酶(CGAS)-STING通路在SARS-CoV-2感染时肺部炎症中的作用提供了新的视角。

新冠肺炎疫情造成了巨大的生命损失，并拖累了全球经济。有报道称，I型干扰素对SARS-CoV-2感染有较大影响，且其作用效果与剂量有关。在感染的晚期，持续高水平的I型干扰素推动免疫病理。因此，在新冠肺炎治疗过程中，适当地调节I型干扰素信号通路是至关重要的。

cGAS-STING通路是I型干扰素应答的重要组成部分。已有多项研究报道cGAS-STING通路参与SARS-CoV-2感染。STING激动剂DiABZI通过刺激I型干扰素反应有效地阻止SARS-CoV-2感染。

Rui等人揭示SARS-CoV-2通过ORF3a和3CL抑制cGAS-STING途径，而周等人表明SARS-CoV-2通过Spike蛋白促进细胞间融合，导致染色质DNA从细胞核穿梭，最终触发cGAS-STING途径。SARS-CoV-2是否通过其他机制在肺泡-毛细血管界面激活cGAS-STING通路仍有待研究。

SARS-CoV2感染的后期会造成上皮细胞线粒体的损伤，导致线粒体DNA(MtDNA)在胞浆中积聚。此外，大量的线粒体DNA过度激活cGAS-STING通路，导致上皮细胞死亡。当巨噬细胞吞噬血管病变处的死亡细胞碎片时，mtDNA触发cGAS-STING信号。巨噬细胞产生大量的1型干扰素，引起强烈的炎症反应。失调的细胞因子反应推动免疫病理，包括组织损伤和急性身体损伤。

SING在炎症中起中心作用，而小分子SING抑制剂H-151在减轻SARS-CoV-2感染后期的免疫病理反应和改善肺部病理方面发挥了重要作用。

总之，Domizio等人揭示了在SARS-CoV-2感染的晚期，STING在增强炎症反应中的独特贡献作用。他们确定了一种STING抑制剂H-151，它可能会作为一种治疗剂，在未来减少对SARS-CoV-2的有害炎症。

出版信息

标题:

STING, a critical contributor to SARS-CoV-2 immunopathology

出版信息:

Signal Transduction and Targeted Therapy，30 March 2022

DOI:

10.1038/s41392-022-00967-3

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Nature Medincine:首个人类主动感染新冠病毒挑战试验，揭开新冠病毒的攻击和传播模式

伦敦帝国理工学院的研究人员在国际顶尖医学期刊 Nature Medincine 上发表了题为：Safety,tolerability and viral kinetics during SARS-CoV-2 human challenge in youngadults 的研究论文。

该研究招募了36名年轻、健康的志愿者，参与了第一次人类新冠挑战性研究。将含有新冠原始毒株的小液体通过滴管滴入志愿者的鼻子中，让他们接触新冠病毒。，其中18人被感染，均为轻症，大约83%的患者丧失了嗅觉，最严重者嗅觉丧失了六个月以上。

更重要的是，这项研究发现，新冠感染者通过咳嗽或喷嚏“发射”的一个小于10微米的液滴就足以让人感染，一个人在被感染后只需要两天就会开始传播病毒。也就是说，患者在出现症状之前就已经散发了很多病毒了。

该文章一经发表，便引起了广泛争议。文中提出将大约100名健康年轻人暴露于新冠病毒之下，以此观察那些接种了候选疫苗的人是否能够避免感染，从而加快新冠疫苗的研发。

在年轻人中，感染新冠后通常是轻微的或无症状的，但这可能会推动社区传播，然而目前人们对于早期感染的详细时间进程和传染性尚未完全明确。对此，给年轻、健康的低风险志愿者人为接种病毒，从而在严格控制的条件下对病毒动力学、免疫反应和传播动力学进行精确的纵向测量。

在这项最新研究中，研究团队招募了36名18-29岁的健康成年人参与了挑战试验，这些志愿者以前没有感染过新冠病毒，也没有接种过新冠疫苗。研究人员通过鼻腔接种让这些志愿者感染了低剂量的野生型新冠毒株。

在34名血清阴性志愿者中，有18人（53%）被感染，病毒载量在接种后5天达到高峰，所有的感染者都出现了针对新冠的特异性IgG和中和抗体。在一开始，研究人员在患者的咽喉中检测到新冠活病毒，随后病毒在鼻子中上升到更高的滴度，并持续了10天。

更重要的是，该研究发现，这些志愿者平均会传播病毒6.5天，最长可达12天，即使他们没有症状。

在18名感染者中，有2名（11%）感染者表现为无症状，其它大部分感染者均为轻症，这些患者有轻微的鼻塞、鼻塞、打喷嚏和喉咙痛，但没有一名患者出现肺部问题。此外，大约83%的患者丧失了嗅觉——至少部分丧失了嗅觉，研究结束六个月后，一名患者的嗅觉仍没有恢复，但情况正在好转。

目前，研究团队计划进行另一项具有挑战性的研究，对感染了Delta突变株的接种疫苗的人群进行研究。

该研究的通讯作者 Christopher Chiu 博士表示：“事实上，没有其他类型的研究可以做到这一点，因为通常情况下，病人只有在他们出现症状时才会引起注意，所以往往会错过了感染早期的所有数据。”

总而言之，这项研究通过首次针对年轻健康成年人的新冠感染挑战研究的详细描述和安全性分析，建立了新冠病毒初次、早期感染过程中的病毒动力学，对新冠传播的公共卫生建议和策防控略具有深远影响。

值得注意的是，这些“人类挑战研究”是有争议的，因为它们有一定的风险——直接感染新冠病毒是否会给志愿者带来无法预估的危险？此外，这种高度受控且受试者性质均一的小规模试验是否可以推广到人群仍有待验证。

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