Nat Rev Cancer重磅: CRISPR在癌症生物学和治疗中的应用

背景：

    在过去的十年里，CRISPR已经成为一个动词，就像它是一个缩略词一样，它改变了生物医学研究，并为剖析细胞生物学的所有方面提供了全新的方法。在癌症研究中，CRISPR和相关工具为我们在理解癌症遗传学、非编码基因组和肿瘤异质性方面以前难以解决的问题提供了一扇窗，并为治疗易感性提供了新的见解。

简介：

2022年2月22日，来自美国威尔康奈尔医学院迈耶癌症中心的Lukas E. Dow教授课题组在Nat Rev Cancer（IF: 60.7）杂志上发表题为“CRISPR in cancer biology and therapy”的综述[1]。在本文中，作者回顾了CRISPR系统作为癌症研究工具的发展进展，以及这些技术改进诊断和治疗的新进展。

主要结果：

在过去的二十年里，肿瘤测序已经产生了几乎所有癌症类型的基因改变的广泛目录。迅速发展的精准医疗策略的成功，取决于能够识别促进癌症生长的驱动突变，并将其从不会促进肿瘤进展的乘客突变中分离出来。在CRISPR出现之前，这依赖于对大量具有不同基因突变、小干扰RNA (siRNA)和短发夹RNA (shRNA)基因沉默和/或突变cDNAs过表达的癌细胞株的比较。CRISPR对这些方法进行了补充和扩展，实现了快速高效的清洁基因敲除(KO)、内源性基因表达调控和直接工程癌症相关的基因组变化。

通过CRISPR敲除揭示基因功能。理解肿瘤发生中基因功能的一个中心方法是自下而上地生成癌症模型，重新创建与癌症相关的事件，以了解它们对过程中每个阶段的贡献。CRISPR除了简化在已建立的癌细胞株中创建简单基因中断的过程外，还能快速创建复杂的类器官培养和动物模型。由于CRISPR-Cas技术的简单和高效，KO小鼠的生产已成为机构核心设施和商业实体的常规实践。此外，通过消除复杂的载体设计和费力的筛选靶向胚胎干细胞(ESCs)的需要，在一个步骤中就可以在体内同时设计多个模型，或者在同一只小鼠中获得基因改变的组合。

图1：CRISPR工具的开发可以应用于癌症生物学的研究。

理解错义突变。癌症中的绝大多数突变是单核苷酸变异(SNVs)，它可能导致蛋白质功能的低、高或新形态变化。CRISPR通过两种主要方式影响了我们设计和研究SNVs的能力。首先，通过靶向DNA DSBs的能力，它增强了基于HDR的基因靶向能力，其次，通过Cas融合酶，它可以直接修饰DNA。CRISPR辅助的HDR已经被有效地用于询问Kras癌基因中不同密码子12和13突变的影响。作者和其他人已经使用HDR驱动的编辑生成了一系列Cre依赖(Lox-stop-Lox (LSL)) Kras突变小鼠的等位基因，这揭示了胰腺和结肠肿瘤起始和进展的意想不到但深刻的差异。此外，来自这些动物的等基因类器官模型强调了靶向治疗的基因型依赖反应，强调了在癌症模型中设计和研究个体SNVs的必要性。

图2：应用CRISPR技术建立癌症模型。

非编码基因组。

在过去的十年里，人类基因组非编码区域的一些突变与癌症风险有关。这并不奇怪，因为这些非编码区包含多种功能元素，调节癌基因、肿瘤抑制基因和相关基因的表达。泛癌遗传关联研究已经确定了非编码区普遍存在的单核苷酸多态性(SNPs)；然而，目前还不清楚它们在肿瘤发生中的作用。另一个影响癌症风险的因素是非编码RNAs (ncRNAs)的失调，它在调节细胞通路中起着至关重要的作用。一些靶向癌症药物的ncRNA目前正在临床试验中，如MRX34，一种microRNA-34a (miR 34a)的模拟物，和cobomarsen，一种miRNA-155的抑制剂。

使用Cas9敲除技术锁定非编码区域。几个研究小组已经使用聚合饱和诱变CRISPR核酸酶筛选来识别一个或多个基因周围的关键顺式调控元件。通过这种方法，作者发现BRAF抑制剂vemurafenib之前建立的抗性基因的顺式调控元件倾向于为5’，并且在开放染色质区域靠近该基因。这项研究展示了如何利用CRISPR突变来构建一个高分辨率的顺式调控元件图，调控一个关键的癌症表型(即耐药性)。

非编码区的抑制和激活。如上所述，通过dCas9可以抑制或激活基因启动子和增强子。虽然仅用dCas9靶向基因区域会在空间上阻断转录因子和RNA聚合酶的结合，但在哺乳动物细胞中，使用融合转录抑制因子模块(如KRAB)通常会更有效。多种KRAB变体已经被开发出来，最近的一项研究表明，在这些变体中，ZIM3 KRAB是最有效的。相反，使用类似的合理设计方法开发了几种基因激活结构：dCas9-VPR, dCas9-VP64与MS2-p65 -HSF1(合称协同激活介质(SAM))和dCas9-SunTag-VP64。

图3：各种CRISPR效应因子的功能域及其在基因组规模筛查中的应用。

突变和克隆异质性。

癌症不是单基因、单克隆或静态疾病。癌细胞不断获得改变，导致复杂的遗传和表观遗传谱。克隆衍生物的分支和竞争随着癌细胞群进化成独特和多样的突变实体，而肿瘤的细胞间组成(癌细胞、间质和免疫细胞)是显著动态的。理解肿瘤内的异质性和肿瘤亚克隆的出现和进化对于构建肿瘤发生的完整图像是重要的。CRISPR技术特别适合解决这些难题，使研究人员既能在细胞群体中设计复杂的癌症相关突变，又能通过CRISPR诱导的基因组修复的遗传疤痕追踪克隆进化。

癌症中复杂突变的建模。各种基因改变组合的累积是癌症的一个标志。正如上面所强调的，CRISPR已经被用于逐步获取癌症驱动变化的模型，但它也可以非常有效地探索不同突变组合的影响。CRISPR编辑技术使创建具有不同突变模式的大量细胞、类器官或动物模型成为可能。作者最近利用这种能力，很容易地混合和匹配遗传事件，以揭示导致获得性耐药的基因型特定背景，而其他突变组合没有观察到这种背景。

克隆战争:追踪肿瘤的进化动态。多种基于CRISPR的策略已经被设计出来，以描述混合种群中不同的克隆，并能够监测随着时间的推移克隆动态。除了在sgRNA文库中包含独特的分子标识来标记CRISPR克隆外，CRISPR机制本身也可以通过包含独特标识的HDR模板集成来引入静态条形码，尽管它也能够进行更多的动态谱系标记。

图4：人类T细胞体外CRISPR工程用于过继T细胞治疗。

CRISPR用于临床癌症治疗。

     CRISPR技术在一系列单基因疾病的临床应用中有令人兴奋的机会，但在癌症治疗的发展中还不是一个主导角色。也就是说，CRISPR在临床癌症管理方面有切实的应用，而且在未来几年，它将在癌症诊断和治疗方面产生影响。

CRISPR-驱动的癌症诊断。由CRISPR机制介导的靶向酶消化可以作为一种诊断工具来识别癌症特定的序列变化。微卫星是一种癌症的诊断标记，可以通过CRISPR介导的针对短串联重复序列STRs)的消化来敏感地检测到，而短串联重复序列是微卫星的组成部分。

基于CRISPR的体外疗法。作为一种仅仅出现了8年的生物技术，CRISPR的首次直接临床应用已经实现，这令人印象深刻。多个课题组研究表明，基于靶向T细胞上的PD1的体外CRISPR可以增强过继转移后的抗肿瘤活性。这种治疗途径已经在临床试验中。在一项初步临床研究中，工程T细胞显示出低的非靶编辑和最小的不良事件。在一项独立的临床研究中，患者的T细胞使用CRISPR-Cas9 gRNA介导的KO进行了类似的工程处理;然而，PD1单独靶向或与内源性TCR (T细胞受体α链常数(TRAC)和T细胞受体β常数(TRBC))基因结合。

体内CRISPR治疗的临床前潜力。如上所述，虽然操纵原发患者来源细胞用于移植是一个具有挑战性的临床目标，但直接用CRISPR靶向肿瘤是一个更加困难的任务。Martinez Lage等人描述了一个针对致癌基因融合的聪明的临床前例子，由于独特的融合和肿瘤促进遗传病变的破坏，提供了肿瘤细胞选择性。在另一个临床前的例子中，Gao等人利用肿瘤细胞中选择性激活的核因子κB (NF-κB)来驱动CRISPR Cas13a组分的转录，并诱导肿瘤细胞限制性癌基因沉默。通过脂质纳米颗粒(LNPs)传递核酸是一个令人兴奋的概念，在作为SARS-CoV-2疫苗的mRNA传递方面取得了巨大成功。在一项针对重要基因polo样激酶1 (PLK1)的概念证明研究中，封装Cas9 mRNA和gRNAs的LNPs显示出有效性，在胶质母细胞瘤小鼠模型中实现了对靶位点的高效基因编辑。总之，这些临床前的努力显示出了希望，但要使CRISPR本身成为可行的癌症临床疗法，还有很多工作要做。

结论和展望：

    CRISPR技术的快速发展已经开始解决我们对癌症的许多基本和令人困惑的问题。通过描述单个基因在癌细胞行为中的作用，使下一代免疫疗法的创造成为可能，归因于周期性编码变异的功能效应，并揭示难以捉摸的非编码和调节元件在肿瘤发生中的作用，CRISPR已经并将继续是，这是我们理解和治疗人类癌症的关键因素。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41568-022-00441-w

参考文献：

[1] Katti A, Diaz BJ, Caragine CM, Sanjana NE, Dow LE. CRISPR in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer. 2022 Feb 22. doi: 10.1038/s41568-022-00441-w. Epub ahead of print. PMID: 35194172.

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