不能更详细！染色质免疫共沉淀（ChIP）实验方法

ChIP 是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息， 确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的 DNA 和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP 技术不断发展和完善， 被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究， 并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与 DNA 芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA 靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA 与蛋白质相互作用的调控网络。

原理

染色质免疫共沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的 DNA 与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的 DNA 片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA 片段，再通过多种下游检测技术（定量 PCR、基因芯片、测序等）来检测此富集片段的 DNA 序列。

交联染色质免疫共沉淀实验方法

1 染色质制备

(1) 取约1 g实验材料, 在液氮中将材料充分研磨, 加入预冷后装有35 mL M1缓冲液的50 mL离心管中涡旋振荡混匀。

(2) 加入972 μL 37%甲醛(终浓度1%), 4°C缓慢旋转孵育10分钟。固定时间可以根据样品特性适当调整。

(3) 加入2.4 mL 2 mol·L–1甘氨酸溶液(终浓度为0.125 mol·L–1)终止交联反应, 4°C缓慢旋转孵育10分钟。

(4) 准备4层神奇滤布, 用双蒸水润洗后将溶液过滤至新的50 mL离心管中。4°C下1 000 ×g离心20分钟, 弃上清。

(5) 用20 mL M2缓冲液重悬沉淀, 注意用移液枪缓慢吹吸避免产生气泡。4°C下1 000 ×g离心20分钟, 弃上清。

(6) 重复以上步骤, 用M2缓冲液再洗1次。

(7) 用8 mL M3缓冲液重悬沉淀, 4°C下1 000 ×g离心 10分钟, 用移液枪尽量去除上清。

(8) 加1 mL核裂解缓冲液重悬沉淀, 转移至2个 1.5 mL离心管中。

(9) 用超声破碎仪打断DNA, 初次使用时, 需要摸索超声条件, 可以取1 μL DNA纯化后的产物进行凝胶电泳, 要求弥散带在200 bp–1 kb之间, 集中富集在200–500 bp。参考超声破碎条件: 强度选择为高, 30秒/ON, 30秒/OFF, 6个循环, 重复2次。

(10) 4°C下16 000 ×g离心15分钟, 合并两管上清(约 1 mL)至新1.5 mL离心管中。

(11) 取100 μL作为给料对照(input)置于–20°C冰箱暂存。

(12) 剩余样品用ChIP稀释缓冲液稀释3–5倍

2 免疫沉淀

(1) 取100 μL Protein A/G Dynabeads, 加1 mL ChIP稀释缓冲液清洗3次后, 用100 μL ChIP稀释缓冲液重悬磁珠, 加入取出给料对照的样品(稀释后)中, 于4°C缓慢旋转, 预杂交染色质1小时。

(2) 将样品置于磁力架上, 转移上清至新的离心管中, 加入1 μg抗体, 于4°C缓慢旋转, 孵育过夜。

(3) 加入100 μL用同样方法清洗后的磁珠, 4°C缓慢旋转孵育1小时。

(4) 将样品置于磁力架上, 弃上清, 依次加入1 mL低盐缓冲液、高盐缓冲液、氯化锂缓冲液、TE缓冲液清洗磁珠, 每次清洗均于4°C缓慢旋转5分钟。

(5) 清洗结束后, 用移液枪尽量吸去上清, 加入250 μL ChIP洗脱缓冲液。

(6) 取出给料对照, 加入150 μL ChIP洗脱缓冲液, 总体积为250 μL, 与实验组样品同时进行后续步骤。

(7) 将样品和给料对照分别于65°C孵育15分钟, 然后将样品置于磁力架上, 转移上清至新的离心管中。

(8) 分别加入250 μL ChIP洗脱缓冲液, 重复洗脱1 次, 将2次洗脱液合并, 体积约为500 μL。

(9) 在洗脱液中分别加入20 μL 5 mol·L–1 NaCl, 65°C 解交联至少6小时, 解交联后可置于–20°C冰箱暂存。

3 DNA纯化

(1) 取出样品放至室温。每管加入31.5 μL蛋白水解缓冲液, 45°C孵育1小时。加入20 μg RNase A, 37°C孵育30分钟。

(2) 加入等体积苯酚、氯仿、异戊醇混合物(25:24:1, v/v/v)抽提, 16 000 ×g离心5分钟。

(3) 取上清液, 按照1:100体积比加入20 mg·mL–1糖原助沉剂, 混匀, 然后按照1:10体积比加入3 mol·L–1 NaAc (pH5.2), 混匀, 最后加入1 mL无水乙醇, –20°C沉淀3小时。

(4) 4°C下16 000 ×g离心20分钟。用70%乙醇洗涤2次。

(5) 弃上清, 待乙醇完全挥发后, 加入100 μL双蒸水, 充分混匀, 即为目的DNA。

4 纯化后分析

对于纯化后的DNA, 可以通过与其它实验结合进行深入分析。若研究特定目的基因的结合情况, 可以采用定量PCR, 以给料对照作为参照, 设置合适的PCR 体系及程序, 分析DNA的富集程度; 若结合二代测序技术进行ChIP-seq, 可以参考DNA文库构建试剂盒 (NEB, Cat No.E7645)进行建库、测序并分析DNA结合情况。

注意事项

(1) 交联。甲醛是最常用的交联剂, 其优点在于形成的交联可逆, 但是需要注意 交联时间, 过度的交联会导致超声波难以破碎, 也有可能造成蛋白质与DNA的间接结合。同时, 甲醛固定后消化酶不能再进行消化。

(2) 染色质切割。无论是X-ChIP还是N-ChIP, 染色质切割都是关键的一步。在使用超声破碎时, 需要摸索破碎条件, 使得染色质断裂的片段分布在200–500 bp之间。影响超声破碎的因素包括样品体积、超声探头深度、超声强度以及超声时间。超声时要保持在4°C。在利用核酸酶进行消化时, 必须严格控制不同样品的消化时间, 过度消化会导致亚核体的形成, 从而阻碍DNA-蛋白质相互作用的检测。

(3) 抗体。抗体是决定实验成败的重要因素, 因此必须选择IP级别的抗体, 同时要考虑单抗与多抗的选择。单抗的特异性强, 但是识别位点单一, 若靶蛋白被其它蛋白或核酸结合会导致该位点被封闭而不能识别。要根据抗体选择对应的Protein A或者G的磁珠。

(4) 操作。实验全程温度尽量保持在4°C, 操作过程中避免起泡。

(5) 结果分析。染色质免疫共沉淀得到DNA片段未必说明抗体识别的目的蛋白能够直接结合DNA。与目的蛋白形成复合体的其它蛋白如果与DNA结合, 也可能富集DNA。

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