英文原题：Investigating the Role of Extracellular Matrix Stiffness in Modulating Ferroptosis Process in Hepatocellular Carcinoma Cells via Scanning Electrochemical Microscopy
通讯作者：李菲，西安交通大学
作者：Yuxiang Zhao (赵宇翔), Zhaoyang Ye (叶朝阳), Yulin Liu (刘禹霖), Junjie Zhang (张俊杰), Shuake Kuermanbayi (曙阿克·库尔曼巴依), Yan Zhou (周彦), Hui Guo (郭卉), Feng Xu (徐峰), Fei Li (李菲)
论文概要
肝癌异常的细胞外力学微环境可调控多种细胞行为并影响肝癌治疗策略效果。近日，西安交通大学生命科学与技术学院仿生工程与生物力学研究所（BEBC）李菲课题组针对细胞力学微环境对肝癌细胞铁死亡过程影响不清的问题，以不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶为肝癌细胞培养基质，构建了模拟早、中、晚期肝癌的细胞力学微环境模型。应用扫描电化学显微镜（SECM）原位表征了细胞力学微环境调控下肝癌细胞的铁死亡早期过程中的细胞膜通透性、呼吸活性、H2O2水平等关键参数的动态变化，发现较高的细胞外基质刚度使Erastin（一种典型的铁死亡诱导剂）造成更严重的肝癌细胞的细胞膜损伤、呼吸活性下降及产生更多的H2O2，表明较高基质刚度上的肝癌细胞对铁死亡诱导更敏感。此发现有助于更好地理解肝癌中力学微环境调控细胞铁死亡的机制。相关研究结果近期以期刊封面文章发表在Analytical Chemistry上。
研究背景
肝癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌发病率、死亡率均居世界首位。探究肝癌发生发展机制和发展新型治疗策略成为近些年人们的研究热点。一方面，肝癌进展常伴随着纤维化和肝硬化，产生肝癌细胞微环境中力学因素（如细胞外基质刚度）的异常改变，因此探究细胞外基质刚度变化与肝癌发生发展机制的互作关系有助于新型抗癌治疗策略的开发。另一方面，铁死亡作为一种铁依赖性的脂质过氧化诱发的细胞程序性死亡方式，是一种很有前景的新型抗肿瘤治疗策略，但目前有关细胞力学微环境中基质刚度对肝癌铁死亡诱导疗法的影响及其调控机制尚不清楚。另外，传统细胞铁死亡表征方法（如荧光染色法和分光光度法）因使用光学探针作为指示剂，可能会耗尽细胞中的目标分子（如H2O2和Fe2+）从而干扰细胞的脂质过氧化反应。因此，为探究细胞力学微环境是否影响肝癌细胞的铁死亡过程，需要对力学微环境中细胞铁死亡过程关键参数变化的原位无损表征方法。SECM是一种以微/纳米电极作为探针的扫描探针显微镜技术，可实现对活细胞消耗或释放化学物质的高时空分辨的原位、无标记表征，可原位表征细胞铁死亡过程的关键参数（如胞膜通透性、氧化还原状态、呼吸活动等）的动态变化，是一种理想的监测细胞铁死亡过程的表征方法。
图文解读
该课题组以不同刚度（4.0、18.0和44.0 kPa）聚丙烯酰胺水凝胶为肝癌HuH7细胞培养的基质材料，构建了模拟肝癌早、中和晚期的力学微环境模型（图1A）。之后，应用SECM原位表征了在不同肝癌细胞力学微环境模型中，加入Erastin后HuH7细胞铁死亡过程的细胞膜通透性、呼吸活性和H2O2水平的原位、动态变化（图1B）。最后，应用转录本测序和分子生物学手段揭示了细胞外基质刚度调控肝癌细胞铁死亡过程的内在分子机制。
图1. 应用SECM研究力学微环境中细胞外基质刚度对肝癌细胞铁死亡过程影响的示意图。
首先，SECM表征HuH7细胞在Erastin处理后铁死亡过程关键参数的实验结果表明，加入Erastin到细胞培养液后，随细胞外基质刚度的增加，HuH7细胞的膜通透性增加（图2A,B）、细胞呼吸活性下降（图2C-E）、释放更多的H2O2（图2F-H）。证实Erastin处理后，高的细胞外基质刚度会促进细胞产生H2O2并加速其脂质过氧化，引发细胞呼吸活性的下降和细胞膜的损伤。
图2. 不同基质刚度聚丙烯酰胺水凝胶上培养的HuH7细胞加入Erastin后铁死亡过程的（A, B）细胞膜通透性、（C-E）呼吸活性、（F-H）H2O2水平的SECM表征结果。
之后，应用转录本测序、免疫荧光、蛋白质印迹和实时定量PCR等方法探究了细胞外基质刚度对HuH7细胞铁死亡过程影响的分子机制。结果表明，较高的细胞外基质刚度上调酰基-CoA合成酶长链家族成员4（ACSL4）和转铁蛋白受体（TFRC）的表达，进而促进HuH7细胞对铁死亡诱导剂的易感性（图3A-D）。此外，介导细胞黏附的整合素（integrin β1）和力学转导的相关蛋白（黏着斑蛋白激酶（FAK））及YES相关蛋白（YAP）在高细胞外基质刚度上的细胞内高表达（图3E-G），并且高基质刚度促进细胞内YAP的入核（图3H,I），表明高细胞外基质刚度激活了细胞的integrin β1-FAK-YAP信号转导通路。
图3. 不同基质刚度聚丙烯酰胺水凝胶上培养的HuH7细胞加入Erastin后（A-D）ACSL4和TFRC及（E-I）integrin β1、FAK和YAP表达水平的表征结果。
为验证YAP与铁死亡相关蛋白ACSL4、TFRC之间是否存在调控关系，利用TED-347（一种YAP转录活性抑制剂）抑制YAP功能后，发现ACSL4和TFRC在细胞的mRNA水平及蛋白水平均下调（图4A-D）。由此推断，高基质刚度促进了integrin β1-FAK-YAP信号转导通路，进而促进了铁死亡相关蛋白TFRC和ACSL4的表达，改变了不同基质刚度肝癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性（图4E）。
图4. 不同基质刚度聚丙烯酰胺水凝胶上培养的HuH7细胞抑制YAP后（A-D）ACSL4和TFRC表达水平的表征结果；（E）基质刚度调控细胞铁死亡的机制示意图。
为确认YAP调控了细胞的铁死亡过程，在抑制HuH7细胞YAP后，进一步应用SECM表征了不同细胞外基质刚度下HuH7细胞的铁死亡过程参数。实验结果表明，抑制YAP后减少了Erastin诱导的细胞膜损伤（图5A,B）、降低了Erastin引起的细胞呼吸活性降低（图5C-E）、减少了Erastin诱导的细胞H2O2的释放（图5F-H）。由此推断出，抑制YAP通过抑制细胞脂质过氧化反应阻碍了HuH7细胞的铁死亡进程。
图5. 不同基质刚度聚丙烯酰胺水凝胶上培养的HuH7细胞抑制YAP后铁死亡过程的（A, B）细胞膜通透性、（C-E）呼吸活性、（F-H）H2O2水平的SECM表征结果。
该工作应用SECM技术实现了对力学微环境影响肝癌细胞铁死亡过程中关键参数（细胞膜通透性、呼吸活性和H2O2释放过程）的原位、动态表征。研究结果表明，高细胞外基质刚度促进了肝癌细胞对铁死亡诱导疗法的敏感性，表明铁死亡诱导疗法可能对治疗具有较高组织刚度的中晚期肝癌患者更有效。该结果有助于理解细胞外力学微环境调控细胞脂质过氧化的相关生物学机制，并可为发展靶向铁死亡的抗肿瘤药物提供参考。
该工作得到了国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、中央高校基础科研基金等项目的资助。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
