感染和骨整合效果不佳是钛基骨科材料植入失败的主要原因，这促使科研工作者开发兼具抗菌和促成骨功能的钛基植入材料。在钛材表面构建氧化锌（ZnO）纳米棒涂层，可以通过物理穿刺作用破坏细菌膜，导致细菌内部物质泄露而达到杀菌效果。这种抗菌策略能够提供持续和广谱的抗菌活性，使细菌更难产生耐药性，从而比使用化学抗菌剂更可取。然而ZnO纳米棒在生理环境中降解速率过快会引发细胞毒性，这限制了其在生物医学中的应用潜力。
中科院深圳先进院王怀雨研究员团队受锌基植入物在体内降解过程的启发，仿生性地提出了将ZnO部分转化成热力学稳定性更高的磷酸锌（Zn3(PO4)2），从而减缓涂层的降解速率的策略（图1）。该策略不仅保持了涂层优异的抗菌性能，解决了ZnO涂层生物相容性差的问题，更是赋予涂层卓越的促骨整合能力。
图1 利用Ti表面的ZnO纳米棒涂层（Ti-ZnO）制备ZnO/Zn3(PO4)2杂化纳米结构（Ti-ZnP2）的工艺示意图，涂层实现了抗菌和促成骨性能之间的平衡。
将Ti基底表面上制备的ZnO纳米棒在磷酸氢二钾溶液中水热处理，溶液中的HPO42−和OH-与溶解的Zn2+反应生成Zn3(PO4)2·4H2O并原位沉积于纳米棒阵列。通过调控水热处理时间可以调整Zn3(PO4)2的转化比例，从而获得散花状的ZnO/Zn3(PO4)2杂化纳米结构（图2）。该纳米结构部分保留了ZnO阵列的纳米棒形貌，极大地降低了涂层的降解速率，减少Zn2+的突释并抑制了表面活性氧自由基的生成。
图2 涂层制备和表征。A） Ti-ZnO （A1）和Ti-ZnP2 （A2）的SEM图像。B） Ti-ZnO （B1）和Ti-ZnP2 （B2） 的纳米棒尖端，以及Ti-ZnP2 （B3）底部的TEM图像。C）XRD图谱。D） XPS测量光谱。E）EDS测定的原子浓度。F）表面粗糙度。G）静态水接触角。
相比于ZnO涂层，ZnO/Zn3(PO4)2杂化涂层不但避免了细胞毒性，而且还显著促进了人源骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的成骨分化，包括提升了ALP活性、胶原分泌、ECM矿化和成骨相关基因的表达。对涂层表面培养的hBMSCs进行转录组测序分析发现（图3），杂化涂层显著上调了“成骨细胞分化”相关基因，而上调基因主要与PI3K-Akt信号通路相关。另外，杂化涂层同样诱导“对锌离子响应”基因显著上调，同时下调了代谢相关基因，如乳酸脱氢酶A（Ldha）、丙酮酸脱氢酶激酶1（Pdk1）和丙酮酸脱氢酶激酶3（Pdk3）等。这些结果表明涂层可能通过释放的Zn2+调控hBMSCs的能量代谢从而促进其成骨分化。
图3 Ti和Ti- ZnP2上培养的hBMSCs转录组测序分析。A）调控细胞成骨分化通路的GSEA分析。B）与细胞成骨分化相关的不同基因热图。C）与细胞成骨分化相关基因的KEGG通路相互作用分析。细胞成骨分化相关基因D）上调、E）下调的蛋白网络互作分析。F）对锌离子响应通路的GSEA分析。G）对锌离子响应通路相关的不同基因的热图。H）Ti- ZnP2组与Ti对照组的代谢相关基因表达差异。
柠檬酸作为线粒体三羧酸循环的重要中间体，同时也在细胞介导的生物矿化过程中，特别是在稳定骨骼中磷灰石纳米晶体方面，起着至关重要的作用。因此，通过分析几种参与代谢的关键酶的基因表达水平，我们初步探究了Zn2+对细胞代谢的影响。结果表明，ZnO/Zn3(PO4)2杂化涂层虽然促进hBMSCs柠檬酸盐产生，但是会抑制柠檬酸的进一步分解代谢，从而减少了总三磷酸腺苷的生成（图4C）。为了补偿能量生成的损失，细胞通过提高葡萄糖利用率和丙酮酸氧化来提高代谢通量，从而进一步增加了柠檬酸的合成。细胞生成的柠檬酸在胞内积累并逐渐分泌到细胞外基质中，并最终促进了胞外基质的矿化（图4D）。上述活跃的代谢过程也反映在线粒体形态的变化上（图4E）。综上所述，从ZnO/Zn3(PO4)2杂化涂层中释放的适量Zn2+不仅可以促进hBMSCs的成骨分化，还可以通过指导细胞的代谢重编程来显著增强胞外基质的矿化。
图4 Ti和Ti- ZnP2上培养hBMSCs成骨诱导7天后的能量代谢。A） ZIP1和ZnT1基因表达。B）糖酵解相关基因表达。C）细胞内ATP水平。D）锌介导的代谢过程示意图。E）线粒体形态TEM图像。F）线粒体宽高比。G）线粒体面积。
通过在涂层表面培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，我们证实了ZnO/Zn3(PO4)2杂化涂层拥有良好的抗菌能力（图4）。在此基础上，通过一系列实验进一步分析了涂层的抗菌机理。总结为，ZnO/Zn3(PO4)2涂层的抗菌作用源于物理穿透、ROS生成和Zn2+的释放。尖锐的纳米结构可以通过物理穿刺作用破坏细菌膜，导致细胞胞内物质泄漏；涂层表层自发生成的ROS可以破坏细胞内蛋白质、核酸和脂质；而持续释放的Zn2+通过螯合胞内蛋白质和失活酶来进一步提升涂层的抗菌性能（图4）。
图4 体外抗菌性能及机制。A）细菌孵育24 h后菌落图像。B）涂层抑菌率。C）孵育12小时后大肠杆菌胞内ROS水平，D）细菌ATP水平，E）细菌蛋白质渗漏，F）大肠杆菌DNA和RNA渗漏。G）Ti-ZnP2杀菌机制
使用植入物相关感染模型，在兔股骨缺损部位植入金黄色葡萄球菌污染的样品，从而评价涂层在感染条件下动物体内的促骨整合效果（图5）。植入两周后取出样品，发现ZnO组和ZnO/Zn3(PO4)2杂化涂层组都可以避免感染的发生。然而组织切片染色后发现，ZnO组样品周围依然出现了较厚的纤维包裹层，这可能与其较差的生物相容性有关。植入6周后对其骨整合性能进行评价。Micro-CT图像显示ZnO/Zn3(PO4)2组周围形成的新骨体积明显大于其他组。HE染色表明该组具有较少的纤维层。顺序荧光染色表明ZnO/Zn3(PO4)2涂层可以促进新骨沉积和重塑。亚甲基蓝-酸性品红染色与HE染色相对应，可以观察到该组的骨与植入体接触的比例最高。总之，体内实验证实，即使在致病菌存在的情况下，ZnO/Zn3(PO4)2植入体也能有效的促进骨整合。
图5 体内抗感染和骨整合效果。A）扫描显微镜观察的植入两周后取出的样品表面的细菌。B）样品表面细菌的涂平板结果。C）计算得出的不同样品的抗菌率。D）不同植入体周围骨组织的micro-CT图像。E-I）micro-CT定量结果，包括（E）BV/TV，（F）Tb. N，（G）Tb. Th，（H） BS/BV和（I）Tb.Sp。（J）H&E染色，黑色点状区域表示纤维层。
综上所述，我们在钛基植入物上成功地将ZnO纳米棒转化为ZnO/Zn3(PO4)2杂化纳米结构。通过优化转化率，涂层降解过程中释放的适量Zn2+不仅可以促进hBMSCs的成骨分化，还可以通过重编程细胞代谢过程来增强细胞介导的胞外基质矿化。ZnO/Zn3(PO4)2涂层既能杀灭致病菌从而避免感染的发生，又能促进新骨再生进而促进骨整合。因此在减轻由新骨生成不佳、细菌感染引起的植入手术失败方面具有重要的临床潜力。相关成果以“Balancing the Anti-Bacterial and Pro-Osteogenic Properties of Ti-Based Implants by Partial Conversion of ZnO Nanorods into Hybrid Zinc Phosphate Nanostructures"为题发表于Advanced Functional Materials上。文章的共同第一作者为赵飞龙（现为北京科技大学博士生）和高昂副研究员，通讯作者为深圳大学总医院口腔科的李歆博士、中科院深圳先进院的童丽萍研究员和王怀雨研究员。
转自：“高分子科学前沿”微信公众号
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