论文内容
研究背景：
近年来，随着工业化的进展，Cd、Pb和Cr等重金属污染已成为一个重大的环境问题，需要在全球范围内紧急补救。重金属影响植物生长，导致作物产量损失。更重要的是，重金属可能会沿着食物链在人体中积累，从而危及人类健康。土壤pH值是影响重金属毒性的关键因素之一。阳离子形式的重金属容易在较高的pH值下被土壤吸附和固定，因此其可用性也会下降。另一方面，随着土壤酸化过程，重金属逐渐解离成游离阳离子，增强了它们对植物的毒性作用。随着植物的生长，根系分泌物，包括氢离子和有机酸，不断分泌到土壤中，导致一种被称为“根际酸化”的现象。这个过程增强了重金属阳离子的活性和毒性，并促进了它们在植物中的积累。因此，迫切需要找到有效的方法来调节根际酸化，减少植物对重金属的吸收。
作为一种有益的元素，硅（Si）可以促进植物生长并增强抗应力性，特别是水稻是一种典型的硅积累作物。Si能够通过“增生障碍物”机制来减轻重金属的毒性。具体来说，Si以硅酸的形式进入植物和凋亡体根的沉积物，通过同时吸收和阻断重金属离子的被动运输来减少重金属离子的吸收。此外，Si影响植物生理学和代谢过程。尽管有报道称Si会影响根系的有机酸分泌，但迄今为止，潜在机制仍然模棱两可。因此，Si通过减缓酸化来减轻体外重金属应力的机制一直被忽视。
先前的研究表明，氢离子和有机酸的分泌是植物长期进化中形成的一种措施，以激活P缺乏的土壤中的磷（P）。P以可溶性状态进入植物，参与生理过程，或者作为固定的P在运输过程中粘附在细胞壁上。然而，磷酸的吸附位点可以与硅酸盐竞争，从而减少细胞壁中的磷保留，并增加可溶性磷浓度。因此，我们假设1）Si可以通过改变P形态和调节根系分泌物来缓冲根际酸化，2）较低程度的根际酸化会降低重金属的生物利用度，从而防止它们被植物吸收。
铬（Cr）是一种重要的工业材料，也是一种容易被植物吸收的有毒重金属。由于其广泛开发，土壤Cr污染在印度、东非、南美洲和中国很普遍。作为一种可变价元素，Cr通常以三价[Cr(III)]存在于稻田的厌氧淹没环境中。在这项研究中，我们使用Cr（III）来说明硅磷途径在缓解水稻重金属应力方面的机制。
研究内容：
1. 植物材料和生长条件
本研究选择了三种大米Nipponbare（粳稻）、Oochikara（粳稻）和Jinzao47（籼稻）。种子用10%的过氧化氢消毒10分钟，用去离子水清洗3次，放在潮湿的滤纸上，在黑暗中在30°C下发芽5天。然后，选择生长稳定的水稻幼苗，并将其转移到1/4强度的Kimura B营养溶液中。营养液的pH值调整为6.0（含钠或氯化氢），每7天更新一次。幼苗生长在人工气候室（30°C，55%相对湿度，14/10小时光/暗期）中生长。选择21天大的幼苗，生长稳定进行实验。
对于硅处理，将硅酸钠在阳离子交换树脂上制备的硅添加到营养溶液中，pH值调整为6.0。研究表明，自发硅酸聚合发生在2 mM，因此本研究确定营养液的硅酸浓度为1 mM。在5个DAT（处理后天）测定Nipponbare的生理指标，包括芽长、根长、芽鲜重、根鲜重和叶绿素浓度（使用SPAD-502叶绿素仪），每个处理5个重复。
2. 根系中根系酸化和有机酸分泌的测定
三个水稻品种在含硅和不含硅的 1/4 浓度 Kimura B 营养液中培养（每盆 4 株水稻，每个品种 5 个重复）。使用 pH 计在 5 DAT 上测量营养液的 pH 值。根据本试验结果，我们选择了添加硅和不添加硅处理营养液pH差异最大的水稻品种进行后续的机理研究。
Oburger 和 Jones (2018) 引用并改进了根系分泌物的收集和测定。具体而言，将添加和未添加Si处理的稻米(Nipponbare)放入纯水中暗培养24小时。收集溶液，用0.22μm滤膜过滤，定容40ml，每个处理5个重复。 40 ml 溶液中的 20 ml 用于通过 TOC 分析仪测定总有机碳 (TOC) 浓度。另20ml冷冻干燥并溶解于2ml去离子水中。使用高效液相色谱法(HPLC)测定柠檬酸和苹果酸的浓度。
3. 基因表达分析
收集5DAT水稻(Nipponbare)幼苗的根。 RNA提取和反转录后，通过RT-qPCR测定质子泵和有机酸分泌基因的表达。使用肌动蛋白作为内参基因。引物如表S1所示。通过2−ΔΔCt方法计算相对基因表达量。每个处理进行五次生物重复和三次机械重复。所选基因包括质子泵基因和有机酸分泌相关基因。其中，质子泵基因OsA1和3充当质膜上的H+-ATP酶，分泌氢离子。 OsALMT 作为阴离子通道驱动苹果酸从根尖细胞质分泌到质膜。 OsFRDL4 是水稻中重要的柠檬酸转运蛋白。 OsART1 和 2 是调节有机酸分泌的转录因子。
1. 植物中Si和P之间的关系
由于根部分泌的氢离子和有机酸直接受 P 调节，因此我们假设 Si 在 P 的帮助下减缓根际酸化。经过和不经过处理的水稻（Nipponbare）的新鲜叶子收集5天的Si并通过微波消解来测定Si、总P、可溶性P和细胞壁P的浓度，每个处理重复3次。总Si和P的浓度通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定。可溶性磷的提取按照Delhaize和Randall的方法（Delhaize和Randall，1995）：称重叶片，液氮冷冻，在研磨机中研磨，然后加入5mol/l硫酸溶液，再次研磨，加入去离子水，离心3000转/分5分钟上清液稀释后，用ICPOES测定P浓度，将其除以叶重换算成可溶性P浓度。
根据Zhong & Lauchli的方法提取细胞壁：将叶子称重，用液氮冷冻，磨成粉末，然后加入到75%乙醇溶液中。静置后，3000 r/min离心5 min，弃上清。然后依次加入丙酮、甲醇-氯仿（v/v = 1:1）和甲醇，重复上述离心步骤。最后，将残渣（细胞壁）进行微波消解，通过ICP-OES测定其中的P浓度，将其除以叶重换算成细胞壁P浓度。
2. 硅减缓酸化对减少大米重金属吸收的贡献
我们设计了一个混合种植实验，以区分减缓酸化对大米（Nipponbare）重金属吸收的贡献。一批水稻幼苗种植了16天，其中一些在含有1 mM硅酸的1/4KimuraB营养溶液中种植了5天，作为早期Si添加处理。残留物继续在KimuraB营养液中生长，没有添加硅。实验于第21天开始。总共设置了三种治疗方法，每种治疗方法有三种重复（图5A）。1）混合种植组：三株未经Si处理的水稻幼苗（称为混合-Si处理）与其他六株预先经过Si处理的幼苗（称为混合+Si处理）一起在Cr（III）应力下在同一盆中生长。2）单一种植组：九株未经Si处理的水稻幼苗（称为Single-Si处理）在同一盆中受到Cr（III）应力。3）对照组：九株水稻幼苗在营养溶液中培养，既没有Cr（III）也没有Si处理（称为CK处理）。在这项研究中，Cr（III）在1/4 KimuraB营养溶液（pH = 6.0）中以100微米的浓度为氯化铬提供。三天后，确定了营养液的pH值。同时，在四种处理（CK、单-Si、混合+Si、混合-Si）的植物中测量了芽长、根长、新鲜重量、根新鲜重量和叶绿素浓度等生理指标。用EDTA溶液和纯净水清洁后，植物被干燥。叶子/芽？根部分别使用HNO3-H2O2（v/v = 5:2）通过微波消化。铬和硅的浓度由ICP-OES测定。
贡献比ρ代表Si对减缓根际酸化以减少Cr吸收的影响比例，根据公式计算：
其中CrS-Si代表单株种植组水稻幼苗中的叶Cr浓度，CrM-Si代表混合种植组中未经Si处理的水稻幼苗中的叶Cr浓度，CrM+Si代表混合种植组中提前进行Si处理的水稻幼苗中的叶Cr浓度。此外，根据Visual MINTEQ，我们计算了Cr（III）和其他重金属（包括Al（III）、Cd（II）、Hg（II）、Pb（II）和Cu（II）在不同pH值下的1/4KimuraB溶液中的离子成分。
1. 数据处理
使用ICP-OES在三次技术复制和三次生物复制中确定了元素浓度。使用R语言进行了t-Test和LSD组的多次比较。P < 0.05表示存在显著差异。在重金属应力实验中，每组的数据被标准化（按最大值划分）并显示为雷达地图。数字是使用Origin构建的。
试验结果：
硅和根际酸化
添加硅减缓了根际酸化。尽管硅处理对除叶绿素浓度外的形态和生理指标影响不大（表S2），但它对三个水稻品种的根际酸化过程有显着阻碍。其中，Nipponbare组营养液pH值差异最大，比未Si处理组高0.6，其次是Jinzao 47（0.42）和Oochikara（0.28）（图1）。同时，添加硅组水稻根系分泌的TOC和有机酸均低于未添加硅组。具体来说，Si处理后，TOC浓度下降了34%，苹果酸和柠檬酸分别下降了25%和18%（图2）。此外，我们还测量了与质子和有机酸分泌相关的基因的表达（图3）。结果显示，添加Si后，调节质子分泌的OsA1和OsA2的表达量分别下降了40%和42%，而苹果酸传出基因OsALMT和柠檬酸传出基因OsFRDL1的表达量分别下降了61%和35%。然而，调节有机酸分泌的转录因子OsART1和OsART2之间没有显着差异。
植物中的Si和P
Si加成组的Si浓度是无Si的2.2倍。虽然添加Si后总芽P浓度几乎没有变化，但植物P分布发生了显著变化（图4A）。尽管添加Si后芽总P浓度几乎没有变化，但植物中P的分配发生了显著变化（图4A）。细胞壁P浓度从532.2微克/克降至463.9微克/克，而可溶性P浓度从577.6微克/克增加到747.7微克/克，其中比例在Si处理后从52%增加到61.7%（图4B）。
硅和铬应力
Si预处理通过降低酸化率来降低营养溶液中的Cr生物利用度，从而减少植物Cr的吸收。在100μM Cr（III）压力下培养3天后，混合组营养溶液的pH值明显高于单组，差异为0.3（图5B）。单组水稻幼苗的生长受到Cr（III）的抑制，其中形态和生理指数显著下降。另一方面，Si治疗提前缓解了这种抑制。有趣的是，与单组相比，混合组中未经Si处理的水稻幼苗也表现出对Cr（III）应激的抵抗力（图5C）。虽然混合组水稻幼苗根部和枝条的Si浓度与单组相似，但发现混合组水稻幼苗的苗叶Cr浓度最低（10.9微克/克），比单组低86%（图6）。此外，混合组营养溶液的pH值比单组高0.3，导致铬离子成分存在巨大差异。具体来说，由于转向复杂形式，Cr3+的比例下降了47%（表1）。因此，在较高的pH值下，营养液中Cr（III）的生物利用度显著下降。同样，我们通过模拟确认了1/4KimuraB营养液的pH值对Al（III）、Cd（II）、Hg（II）、Pb（II）和Cu（II）离子成分的影响（表S3）。对于所有这些金属阳离子，生物利用离子的百分比在较高的pH值下会下降。有趣的是，我们发现根际酸化障碍的机制有助于Si使用Eq减少Cr（III）吸收的63%。
研究结论：
在我们的研究中，我们发现了一种新的外在机制，通过这种机制，硅磷途径通过减少根际酸化来降低环境中重金属的生物利用度，最终减少植物对重金属的吸收（图7）。根际酸化的减少是由于Si在植物中的可溶性P容量增加。Si可以通过竞争性吸附占据细胞壁上的P吸附位点，减少细胞壁P，并增加可溶性P。在促进细胞壁P转化为可溶性P后，P作为信号分子，可以调节质子泵和有机酸相关基因，降低根际酸化速度，并减少植物对重金属的吸收。此外，P是植物细胞结构的重要组成部分，如细胞膜、核酸和能量分子ATP。然而，它也参与了植物的许多生理过程，如光合作用和呼吸。
在这项研究中，我们选择了水培实验来研究硅磷通路机制，以减轻重金属应力。与土壤种植相比，水培实验除了易于养分可用性和pH值控制外，还消除了因素（例如土壤微生物群和土壤特性）的影响，以及采样，这有助于我们更清楚地揭示机制。然而，我们也应该认识到，土壤培植对农业推广有更直接的参考价值。然而，由于土壤的缓冲能力高，土壤耕作条件不会导致短期pH值的显著变化。因此，在未来的研究中需要更多的灌装实验和长期实地实验，以确认硅肥在根际酸化中的抑制作用，并开发硅基材料，并指导硅肥的田间应用，促进可持续农业发展。此外，本研究中使用的水稻品种有限，随后需要对更多品种甚至更多物种进行研究。
在本文中，根据在Nipponbare获得的结果，我们揭示了一种新的硅磷途径，该途径通过阻碍根际酸化来降低重金属的生物利用度。我们的研究为合理应用硅肥提高植物磷利用效率、降低土壤酸化率和缓解植物重金属压力提供了理论参考。
期刊信息
期刊：Science of the Total Environment
影响因子（2022）：9.8
中科院分区：环境科学与生态学一区
转自：“农科学术圈”微信公众号
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