英文原题：Unveiling Polyhexamethylene Guanidine Regulating Behaviors on Methane Generation in a Sludge Anaerobic Digester: Interactive Process, Microbial Metabolic Trait Interference, and Adaptive Mechanisms
第一作者：王凤 (博士研究生，河海大学)
通讯作者：罗景阳 (教授，河海大学)等
作者：Feng Wang, Yuting Luo, Wenxuan Huang, Jiale Chen, Jiashun Cao, Leiyu Feng, Xiang Li, Gang Zhao, Yang Wu, Jingyang Luo
系统揭示了聚六亚甲基胍对污泥厌氧消化溶解、水解、酸化和产甲烷阶段影响，探究其与胞外聚合物相互作用过程，通过物理化学、分子分析及宏基因组等解析微生物对其胁迫剂量的潜在作用机制，为深入了解新污染物的环境影响行为和防控提供了参考。
本研究以聚六亚甲基胍(PHMG)为代表，研究其在剩余污泥(WAS)厌氧消化过程中的环境行为。PHMG作为安全高效的消毒剂广泛应用于日常生活中，2017年胍类消毒剂产量达到5.6万吨。在本文中，首先表征了PHMG对WAS消化过程中甲烷产量的影响。然后，探究了PHMG对WAS消化的特定阶段的影响，包括溶解、水解、酸化和产甲烷过程。此外，通过16S rRNA和宏基因组分析，综合研究了甲烷产生过程中微生物群落结构变化和相关代谢功能特性。此外，通过光谱分析综合考察了PHMG对种间电子转移(IET)的影响以及胞外聚合物(EPS)与PHMG的相互作用过程，深入挖掘相互作用机理。本研究将有助于深入了解WAS中新污染物(ECs)对厌氧消化性能的影响，并揭示厌氧系统中微生物对外源污染物胁迫的剂量响应机制。
图1. WAS消化过程中累积甲烷产量
PHMG对甲烷产量的影响符合Gompertz模型。对照组在40 d时甲烷累积产量为92.2±2.4 mL/g VSS，与模拟结果(95.4±4.5 mL/g VSS)接近。低剂量PHMG (40 mg/g TSS PHMG)反应器存在明显的滞后期，但随着消化的进行，滞后期逐渐恢复，最终甲烷累积量达到82.0±1.3 mL/g VSS。当WAS中PHMG浓度进一步增加到100和400 mg/g TSS时，在整个消化过程中检测到的甲烷可以忽略不计，表明高浓度PHMG对WAS消化有明显的抑制作用。因此，PHMG的存在对CH4的产生存在剂量依赖性的抑制作用，厌氧微生物似乎能够耐受低水平的PHMG并保持代谢活性。
图2. PHMG对WAS厌氧消化过程中碳水化合物(A)、蛋白(B)、NH4+-N (C)、PO43--P (D)、水解速率(E)和VFAs的影响
WAS的消化主要分为增溶、水解、酸化和产甲烷四个阶段，其效率与最终产甲烷量直接相关。有趣的是，PHMG明显抑制了甲烷累积产率，但它显著提高了溶解、水解和酸化效率。随着PHMG剂量的增加，可溶性碳水化合物和蛋白质浓度发生不同程度的增加。同样，NH4+-N和PO43--P(表明水解效率)的浓度也分别提高，表明PHMG对溶解和水解具有促作用。这些结果与基于单底物模型的水解速率(k, d-1)现象一致，置信区域向右下移，表明PHMG改善了水解过程，但抑制了产甲烷潜力。R0和R1的VFAs减少对应于甲烷的生成。虽然100 mg/g TSS PHMG也能显著促进VFAs的产生，但其对产甲烷菌的强烈抑制不利于VFAs向甲烷的生物转化，从而导致VFAs的累积。
图3. 细菌(A)和古菌(B)在属水平上的相对丰度(%)
功能性厌氧物种在厌氧系统中起着至关重要的作用。低浓度PHMG在16 d时略微提高了水解/酸化细菌的相对丰度，这与PHMG对水解和酸化的促进作用是一致的。然而，这些功能细菌的丰度在过量PHMG暴露下普遍减少。水解菌和产酸菌在低浓度环境下能够承受PHMG的胁迫，而在高浓度环境下则不能承受。古菌的变化中也观察到PHMG的剂量依赖性抑制。产甲烷菌的减少无疑会降低产甲烷的效率。然而，随着消化的进行，低浓度PHMG抑制作用逐渐减弱，而过量PHMG的抑制作用仍在继续，这可以解释不同反应器产甲烷的差异。
图4. 电子转移(A)，UV-vis(B)，F420的相对丰度(%，对照的100%)(C)，产酸(D)和产甲烷(E)的代谢途径，功能基因的相对丰度(‰)(F)
甲烷的高效产生本质上与各种电子穿梭的种间电子转移(IET)有关。IET在PHMG条件下发生抑制。值得注意的是，在低PHMG条件下电子传递能力逐渐恢复，这与R1的产甲烷能力恢复趋势一致。功能微生物的变化也揭示了PHMG对IET的抑制作用。例如，Desulfobulbus和Clostridium sensu stricto 12在电子传递中起着至关重要的作用，在PHMG诱导的反应器中均被抑制。因此PHMG引发的细菌与古菌间IET的限制会影响物质和能量的交换，从而降低微生物的活性和甲烷产量。
从甲烷生物合成的角度来看，底物代谢和VFAs生物合成途径对甲烷生成至关重要。在低浓度PHMG条件下，底物代谢和VFAs生物合成途径普遍增强，而在高PHMG条件下则减弱。有趣的是，PHMG更容易影响蛋白质代谢，而与多糖代谢相关的基因的相对丰度变化不显著。乙酸甲烷生成的关键前体，在低PHMG反应器中丙酮酸代谢成乙酸的相对较高的活性也可能有助于甲烷生成的恢复。同时，产甲烷途径均受到PHMG暴露的影响。值得注意的是，在低PHMG反应器中，产甲烷活性得到了部分恢复。
总体而言，PHMG暴露显著降低了产甲烷相关功能基因的相对丰度，不利于甲烷的产生。在低PHMG条件下，产甲烷活性可以部分恢复，而在高PHMG胁迫条件下，这种抑制是永久性的。
图5. Zeta(A)、UV-vis(B)、FTIR(C)、同步(D)和异步(E)光谱、LDH(F)、蛋白质二级结构(1600-1700 cm-1) (G)、分子对接(黄色:PHMG，白色:氢键，粉色:氨基酸残基)(H)和TEM图像(I)
作为微生物的保护层，EPS可以帮助微生物对抗外源性有毒污染物。WAS中的微生物一般带负电，R0中的Zeta电位为−16.6 mV。然而，胍基在PHMG中表现出带正电的聚合物，能够与带负电的WAS结合。R1和R3的Zeta电位分别提高到6.9和14.2 mV。此外，与单独的EPS相比，EPS+PHMG体系的紫外吸光度显著增强，这也是物质特性改变的明显指标，暗示PHMG和EPS的结合。利用2D COS FTIR进一步揭示了EPS与PHMG的相互作用机制，验证了PHMG优先与WAS中的蛋白物质相互作用。此外，表征蛋白质二级结构密度的a-helix/(β-sheet+random coil)的比值分别从R0中的70.0%降低到R1中的41.3%和R3中的36.2%，这也证明了PHMG有破坏蛋白质结构的倾向，从而提高了溶解和水解效率。分子对接表明，氨基酸残基(牛血清白蛋白，3种类型)可以自发地与PHMG结合，通过氢键鉴定出GLU-424和LEU-112为结合位点。
此外，PHMG对EPS的破坏还会使细胞膜失去保护屏障。LDH是膜通透性的直接指标，与R0相比，R1和R3的LDH释放量分别提高了52.1和164.3%。PHMG对细胞膜的破坏作用会破坏核黄素、c-Cyts和吩那嗪，导致IET减少。这些结果与c-Cyts含量和IET通路的分析一致。
此外，PHMG可能进一步接触细胞，干扰细胞生长和繁殖，从而下调参与甲烷生物合成的代谢途径。值得注意的是，外部ECs通常通过产生活性氧(ROS)来诱导DNA损伤反应(SOS反应)，以应对恶劣的环境。暴露于PHMG时，与ROS产生相关的基因丰度增加，表明PHMG可能导致DNA损伤。此外，TEM分析发现，暴露于PHMG下的微生物出现多处横膈膜内陷，不利于DNA分裂和增殖。这些结果表明，PHMG通过干扰DNA结构和微生物复制来影响微生物活性，从而导致甲烷产量降低。
此外，微生物对有毒污染物可以做出适应性机制。例如，在低PHMG反应器中，对于古菌DNA复制至关重要的基因FEN1的相对丰度在第16和40天分别为0.0025和0.0158‰。在16和40 d时，这一比例明显高于对照组(分别为0.0023‰和0.0117‰)，但在高PHMG胁迫下没有发现。同样，在PHMG反应器中，负责隔膜形成的ftsQ的相对丰度也降低了。但随着WAS厌氧消化的进行，与对照组相比，R1增加了21%。同时，LuxR/I系统是产甲烷菌重要的群体感应信号系统，有助于古菌对有毒物质的适应。
图6. PHMG对WAS厌氧消化产甲烷的影响机制
一般来说，PHMG首先通过电中和作用与WAS结合，然后与WAS相互作用破坏EPS(尤其是蛋白质)。PHMG在破坏细胞膜后，会进入微生物细胞，诱导形成隔膜内陷，干扰DNA分裂和增殖。这将不利于微生物的生长、IET的能力和与甲烷产生有关的代谢途径。然而，一些功能物种可以通过上调与微生物生长相关的功能基因和激活群体感应信号系统(如LuxR/I系统)来耐受低水平的PHMG，有助于逐渐恢复产甲烷的代谢活动。本项工作揭示了暴露于ECs(即PHMG)导致WAS厌氧消化性能的恶化，为解读微生物对外源污染物的响应提供了新的认识，并为ECs毒性的调控提供了指导。
作者简介：
王凤
河海大学环境学院23级市政工程博士生，主要研究方向为新污染物的环境影响行为及防控，以第一作者（或导师一作本人二作）在ACS ES&T Engineering等期刊发表SCI论文7篇。
罗景阳
河海大学教授、博士生导师，环境学院市政工程系主任。江苏省青蓝工程优秀青年骨干教师、江苏省环境科学学会“优秀青年科技者”、河海大学“大禹学者”和青年岗位能手、IWA青年委员、中国沼气学会青年专家委员等。主要从事有机废物的资源化利用及有毒有害污染物控制理论与技术等。主持负责国家自然科学基金（面上+青年）、江苏省自然科学基金、江苏省碳达峰碳中和科技创新专项（子课题）、中国博士后科学基金（面上+特助）、江苏省太湖办课题等10余项。以第一或通讯作者在ES&T、WR等环境类期刊发表高水平论文100余篇（累计ESI 高被引8篇，热点论文3篇），申请授权国家发明专利10余项。担任Frontier in Microbiology的副主编，Chinese Chemical Letter、Journal of Hazardous Materials Advances、 Results in Engineering、中国给水排水等多个期刊青年编委。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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