ACS Chem. Biol. | 共价靶向作为抑制NLPR3炎症小体组装的通用策略

英文原题：Covalent Targeting As a Common Mechanism for Inhibiting NLRP3 Inflammasome Assembly

通讯作者：R. Luke Wiseman；Michael J. Bollong 斯克利普斯研究所

供稿人：郭玮明 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇题为“‘Covalent Targeting As a Common Mechanism for Inhibiting NLRP3 Inflammasome Assembly”的ACS Chem. Biol.文章，文章的通讯作者是美国斯克利普斯研究所（The Scripps Research Institute）的R. Luke Wiseman和Michael J. Bollong教授。

NLRP3炎症小体是一类非常重要的蛋白质复合物，定位于细胞质中，对炎症相关的细胞因子的加工和分泌起到了调控作用，因此开发出有效的NLRP3的抑制剂具有重大的生物研究意义和临床应用价值。目前，能够抑制NLRP3的ATP酶活性的抑制剂OLT1177目前已经成功通过了痛风和骨关节炎的II期临床试验。考虑到亲电试剂能够共价修饰NLRP3的半胱氨酸进而调节该复合物的活性，许多新近开发的NLRP3抑制剂均借助了半胱氨酸依赖的调控机制。其中，部分抑制剂（例如Oridonin，RRx-001等）共价结合NLRP3的半胱氨酸，阻断了其与NEK7的结合，进而阻断了炎症小体的组装；另一部分抑制剂（例如Bay-11-7082，MNS等）则被认为共价靶向NLPR3的ATP活性口袋中的半胱氨酸，抑制了ATP酶的活性。进一步深入研究NLRP3的共价抑制能够让人们更加了解 NLRP3的激活机制，并为NLRP3 炎症小体抑制剂的开发提供新的思路和途径。

作者开发了一种对于NLRP3炎症小体组装抑制剂的高通量筛选技术平台。在THP-1细胞中稳转ASC-GFP。没有刺激的情况下，ASC-GFP弥散在细胞质中，利用脂多糖和尼日利亚菌素处理后，ASC会自发组装形成离散的点状物（ASC斑点），它反应了炎症小体的组装情况。使用384孔板外加高内涵成像显微镜检测不同化合物对于细胞中ASC斑点的影响，即可进行抑制剂的高通量筛选（图1）。

图1. 高通量筛选NLRP3炎症小体组装的抑制剂

他们使用这种检测方法筛选了含有约 13700 种经过广泛临床前或临床试验的化合物的Calibr ReFRAME 文库，在其中发现了111 个抑制炎症小体组装的分子。其中有17个是已知的HSP90抑制剂，HSP90在炎症小体组装中发挥重要作用，同时，他们还鉴定到了15种具有已知能够和半胱氨酸反应基团的化合物，这些化合物可能能够共价抑制炎症小体的组装。随后，他们进一步扩大了库容量，增加了一个含有2600种核苷模拟物的文库和一个含有3575种共价抑制剂的文库。他们发现了487 种抑制炎症小体组装的化合物，绝大多数化合物都含有亲电基团，这表明它们可能通过共价抑制机制发挥作用（图1）。他们后续建立了二次筛选试验，以评估鉴定的炎症小体组装抑制剂是否也减少了IL-1β的分泌或是细胞的焦亡。他们鉴定出的所有优先靶向NLRP3的抑制剂都减少了IL-1β的分泌，并提高了刺激后THP-1细胞的活力，证明了NLRP3抑制剂除了阻断炎症小体组装外，还阻断了炎症小体产生后下游产物的活性。

作者选择了他们筛选出的最有效的化合物VLX1570进行后一步研究。他们发现VLX1570能够抑制小鼠巨噬细胞系RAW264.7以及原代树突细胞的IL-1β 的分泌。随后，他们也证明了VLX1570能够抑制脂多糖刺激小鼠体内IL-1β和IL-6的水平（图2）。VLX1570具有多个潜在的和半胱氨酸反应的位点。免疫印记显示，VLX1570会导致NLRP3的交联，形成大量高分子量的产物（图2）。NLRP3任何一个截断结构域在VLX1570处理后都产生了交联的高分子量产物。将其中PYN结构域上的四个半胱氨酸全部突变，PYN结构域截断体的交联完全消失，将半胱氨酸重新引入则又能出现修饰或交联条带（图2）。

图2. VLX1570通过半胱氨酸的共价修饰促进NLRP3的分子间交联

随后，作者又选择了带有两种不同基团的抑制剂进行研究。一种是带2-磺酰基嘧啶基团的抑制剂D053-0025，另一种是带有氯乙酰胺的支架K784-5117。二者均能够抑制细胞的焦亡。借助构效关系分析，作者还尝试了为D053-0025加上了炔基探针（P207-9174），以及为K784-5117加上了炔基探针（mCMF859），修饰后的抑制剂也能够抑制ASC斑点的形成（图3）。P207-9174和mCMF859均能够共价标记NLRP3但不标记其他炎症小体组分或是炎症小体其他部分。同时，作者发现D053-0025对蛋白质组中其他蛋白质的半胱氨酸不具有广泛的反应性，借助isoTOP-ABPP的方法，他们在超过18000个半胱氨酸位点中仅仅发现了11个半胱氨酸的结合产物。可是质谱方法并没有能够打到D053-0025对于NLRP3的具体修饰位点。免疫印迹实验表明，D053-0025可能对于NLRP3的多个结构域的多个半胱氨酸均具有共价结合能力。

图3.  含有2-磺酰基嘧啶基的NLRP3炎症小体组装抑制剂

总而言之，作者筛选到了一系列能够共价抑制NLRP3炎症小体组装的化合物。但是，其问题也非常明显。这些化合物会结合到NLRP3的不同半胱氨酸位点，虽然能够显著抑制炎症小体组装，但对多个半胱氨酸的修饰使得很难通过构效关系分析来增加共价化合物的效力。同时，在筛选过程中并未针对化合物的靶向性，其特异性有待进一步提高。不过，这些研究结果显示了NLRP3对亲电基团的敏感性，未来可能会基于此开发出更有效和更特异的 NLRP3 抑制剂，应用于炎症性疾病的治疗。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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