PBJ | 利用人工合成的诱导型启动子提高杨树基因在逆境胁迫下的表达

植物合成生物学在生物燃料、药物生产和利用植物细胞系统的食品生产上的可持续应用方面做出了重大贡献。目前合成生物产品的成功要求在工业环境中应用更有效的技术和植物平台。迄今为止，各种合成生物学的创新已经应用于生物传感器、作物开发和使用各种植物资源的合成生物产品。在这些技术中，合成启动子设计是目的基因在植物中表达的一项极有吸引力的研究。响应压力或发育信号后，跨越数百个DNA序列，覆盖了许多不同的顺式调节元件的植物天然启动子将多余的转录因子招募到重叠而狭窄的DNA片段，这导致靶向基因表达过于复杂。而合成启动子可用于精确调控特定发育阶段和组织/器官的时空基因表达。随着植物单细胞生物学和合成生物学的最新进展，可以期待在植物中开发强大的人工合成组织和细胞型特异启动子。杨树胁迫响应型合成启动子以前是利用整个杨树组织的RNA-seq结果从胁迫诱导启动子设计的，然而，这些启动子在缺水或高盐处理下没有表现出组织特异性。通过将这些方法与细胞类型特异性RNA-seq技术相结合，可以生成更高级的组织特异性和细胞特异性启动子。

近日美国田纳西大学农业研究所农业合成生物学中心C. Neal Stewart Jr团队在植物学顶级期刊Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Novel synthetic inducible promoters controlling gene expression during water-deficit stress with green tissue specificity in transgenic poplar”的研究型论文。研究人员通过激光捕获显微解剖低输入RNA-seq分析，从水分胁迫杨树(Populus tremula ×Populus alba)叶栅栏和维管细胞特异表达基因的启动子序列中鉴定了新的保守DNA基序。在水分亏缺胁迫条件下，从叶肉细胞和维管细胞两种主要叶细胞类型的差异表达基因启动子中，合成了含有6个20个碱基重复序列的保守DNA序列的启动子。在水分亏缺胁迫下，对Syn3 (20 bp核心序列)及其两个衍生物(Syn3的10 bp 5′端或3′端)进行了组织器官特异性筛选。结果表明，Syn3和Syn3-10b-1(Syn3的10 bp 5′端序列6次重复)均为绿色组织特异性启动子，其中Syn3为绿色组织优先组成启动子，Syn3-10b-1为绿色组织特异性和水分缺失诱导启动子。

首先，为了开发组织特异性和缺水胁迫诱导的合成启动子，研究人员认为有必要通过细胞类型特异性RNA-seq分析鉴定叶片组织特异性水分亏缺胁迫诱导基因。在水分胁迫下，对在叶片栅栏细胞高效表达的3个基因和维管细胞高效表达的3个基因进行表达差异分析。数据证实，根据的转录组学分析选择的大部分基因在亏水胁迫下的绿色组织中表达。因此，假设这些基因的启动子包含绿色组织特异性的顺式作用元件，并由缺水胁迫诱导。

图1 单细胞RNA-seq分析中基于叶片特异性表达的选择基因的内源基因表达

研究人员通过之前的实验已经证明，在高盐或缺水处理等刺激诱导下，使用 单个CRE基序首尾重复的合成启动子格式在瞬时试验和稳定的转基因植物中都能有效地诱导标记基因表达。四个保守的20碱基基序的六聚体序列被插入到每个合成启动子结构中。其中两个合成启动子(Syn2和Syn3)在0.5 M甘露醇溶液中孵育的转化杨树叶肉原生质体中诱导GFP（图2）。

图2单细胞RNA-seq分析中基于叶片特异性表达的选择基因的内源基因表达

合成启动子可以使用短顺式调节元件(CREs)和核心启动子序列来设计特定用途。为了从一个有价值的20碱基Syn3的基本序列(GTTAACTTCAGGGCCTGTGG)确定长度和序列的影响，这个序列5′端和3′端区域的10个碱基被设计成6次重复，产生两个更短的合成启动子，Syn3-10b-1(50′:GTTAACTTCA)和Syn3-10b-2(30′:GGGCCTGTGG)。将这些启动子的活性与植物中的Syn3进行了比较。Syn3和Syn3-10b-1在停水3天的瞬时农杆菌侵染本氏烟草叶片中被特异性诱导。在稳定转基因杨树中，Syn3表现为一种组成型启动子，但在叶片中具有最高的活性。在水分胁迫条件下，Syn3-10b-1在绿色组织中的诱导作用比对照更强。因此，在转基因杨树中，含有Syn3 5′序列的合成启动子既具有组织特异性，又具有缺水诱导性，而3′序列则没有。

图3高盐缺水条件下Syn3及其两个衍生合成启动子对本氏烟草叶片的农杆菌侵染瞬时转化试验

图4转基因杨树合成启动子驱动GUS基因的二元载体构建

在非胁迫条件下，Syn3在叶片中高度活跃，在茎和根中 程度较低，而Syn3-10b-1则没有这种特征。Syn3-10b-1被证明在水分亏缺条件下，在叶和茎中高度诱导GUS基因表达和GUS基因转录，并具有组织特异性。这些启动子的下游基因在缺水处理下的叶片组织中被高度诱导。两个绿色组织特异性诱导启动子Syn3和Syn3-10b-1在稳定的转基因杂交杨树中诱导下游GUS基因(图5)。在稳定的转基因杨树中，Syn3-10b-1对水分亏缺胁迫有响应，而Syn3虽然在其大序列中含有Syn3-10b-1序列，但没有响应。此外，基于Syn3 3′序列的Syn3-10b-2合成启动子并没有诱导可靠的组织特异性或胁迫响应性。

为了验证Syn3-10b-1对GUS基因表达的正诱导是对缺水条件的响应，研究人员比较了转叶萎蔫杨树和模拟对照 物三个器官中GUS转录物的丰度。作为转化对照，在所 有转基因系中检测到LUC基因的相对变化范围为30-600 倍，而野生型杨树未显示任何LUC基因表达。

图5水分亏缺胁迫下转基因Syn3-10b-1杨树再生叶、茎、根组织GUS诱导

茎组织中CCR1功能的降低导致抗性的降低，从而增加了转基因植物的糖化。本研究中Syn3-10b-1和Syn3的茎组织特异性似乎与SNBE合成启动子相似。因此，将这些合成启动子与杨树次生细胞壁生物合成相关基因一起应用，可以在转录水平上操纵生物量相关代谢途径。另外，将来还需要对含有现有合成启动子突变序列的合成启动子构建物进行更精确 的实验，以阐明现有合成启动子的组织特异性和水分胁迫作用。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14289

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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