这是一只完整的成年小鼠（包含皮肤、内脏、骨骼、肌肉）。视频展示的是全世界首次实现的成年小鼠全身神经系统均一的微米级分辨率三维成像。这一突破是借助一种名为 TESOS（Transparent Embedding Solvent System）的新原理透明化技术完成的。近日，北京脑科学与类脑研究所赵瑚教授团队（一作为四川大学华西口腔医学院伊亚婷、张士文、门乙，北京脑科学与类脑研究所博士生李有淇）于 Cell Research 发表题为 Mapping of individual sensory nerve axons from digits to spinal cord with the transparent embedding solvent system 的封面文章，报道了这一新技术及其应用。
生物医学成像正在由二维走向三维。获取完整的生物组织介观尺度三维结构信息是生命科学基础研究的重要目标。然而，组织的不透明性极大地阻碍了光学成像的深度。为什么生物物质看起来是不透明的呢？首要原因是光的散射。生物组织中含有水、脂肪、蛋白质、矿物质等多种成分，其不均匀分布会导致光发生强烈的散射，使光无法直接穿过组织。另一方面，机体内的血红蛋白、黑色素等物质可吸收光，限制光线通过。为了解决上述两个问题，组织透明化技术由此诞生。一方面，通过脱色技术减少光的吸收，另一方面，利用含有高折射率介质的透明液取代样本中水分和脂质，平衡组织折射率，减少光的散射，从而使组织实现光学透明。
一个常见生活现象可以很好地帮助我们理解组织透明化技术的原理。当我们把一整块透明的冰砸碎后，冰渣是不透明的白色。因为里面的水、冰、空气三种组分折射率差异巨大。接着我们把碎冰放入水中，冰渣会立刻变回透明。组织透明化技术的过程其实与此过程原理完全一致。
赵瑚教授团队是著名的全组织透明化技术 PEGASOS (Polyethylene glycol (PEG) Associated Solvent System) 的开创者。自 2018 年问世以来，PEGASOS 技术凭借其「透明度高、内源性荧光保存好、易用无毒无挥发，适用性广」等优势获得诸多研究者的认可，成为一种被广泛应用的组织透明化方法。然而，无论是 PEGASOS 技术还是其他的油性、水性、水凝胶组织透明化技术，至今都无法很好地实现全脑介观神经投射图谱的构建，而包含外周和中枢神经在内的全身完整神经的高分辨率成像及投射重建似乎更是天方夜谭。究其原因，主要是：1）样本无法做到完全透明，随着成像深度增加，微小的光学象差累积，造成荧光信号质量和信号强度的丢失；2）高分辨率镜头往往工作距离有限，不能拍摄太厚的样本。
那么，有没有一种办法可以突破这种限制呢？新概念的 TESOS 透明化包埋技术应运而生。
透明化包埋是赵瑚教授团队提出的一个透明化技术新概念。简而言之，它是组织透明化与组织块切割的结合。赵瑚教授团队研发了一种以牙科复合树脂单体双酚 A 乙氧基二丙烯酸酯（BED）与高折射率的苯甲酸苄酯 (BB) 为主要组分的新型组织透明液。经过一系列处理，这个透明液能像一般的有机溶剂类透明液一样把各类软硬组织变得高度透明。接着，用紫外光短时间照射后，透明液会和组织一起发生交联聚合变成一块坚硬透明的树脂，树脂本身如同有机玻璃一般透明，从内到外把组织包埋起来，而样本同样维持透明，犹如一块琥珀。与新鲜脑组织相比，透明化包埋过程将大脑强度提升了 150 倍以上，在质地上甚至强于石蜡包埋样本。良好的机械强度赋予了透明化包埋样本极好的切割性能。无论是硬组织还是软组织，对样本进行切削或者磨削均可获得近乎镜面级的加工面，从而避免了形变。值得一提的是，上述透明化包埋的技术灵感来自于牙科临床实践。团队主要成员以前均为国内顶尖口腔医学院川大华西口腔的临床医生，他们从口腔光固化复合树脂修复牙体的经历获得启发，从而设计出上述配方和技术路线。
图 1.TESOS 透明化包埋方法能够实现组织良好的透明度和机械强度
接着，赵瑚团队设计了一套放置样本的 Magmount 装置。该装置用于将透明化包埋样本放置于显微镜载物台，同时实现样本的灵活转移和精确复位。有了透明化包埋样本+ Magmount 装置 + 石蜡切片机，TESOS 技术可以与市面上几乎所有商用正置共聚焦/双光子/光片显微镜体系（Leica, Nikon, Olympus, Zeiss, 3i 等等）结合，实现任意组织类型大样本高分辨成像。无需单独开发专用成像系统，也无需对显微镜本身做改动。这种高度的灵活性是 TESOS 技术的一个巨大优势。与传统切片成像体系比如 fMOST，ViSoR 或者 Mouselight 相比，TESOS 大大降低了神经连接图谱成像这一高大上技术的实现成本。
透明化包埋后的样本拍摄过程简单明了。样本粘结于 Magmount 装置，一起固定于载物台上，用选定镜头像拍切片一样对样本表面三维图像块进行深度成像。拍摄深度取决于镜头工作距离以及对分辨率的需求。拍完表浅区块后，将样本转移至石蜡切片机切削掉成像过的区域（或使用电机磨削），然后再转移回显微镜拍摄下一个三维图像块。最后基于图像块之间的重叠区域拼接为完整的大三维图像块。比如说，我们可以使用最常用于拍摄切片的高分辨率 40×/1.3NA 油镜（工作距离 240 微米）拍摄样本表面大概 350 微米厚度的样本（TESOS 样本无需盖玻片，从而可以拓展 170 微米的工作距离），然后切片机切削去约 300 微米厚度，接着拍摄下一个 350 微米厚度组织块。最后通过约 50 微米的重叠区将上下两个图像块拼接成为一个 650 微米厚度连续图像块。重复上述操作，就可使用高分辨率短工作距离镜头拍摄任意大小样本。小型的图像数据拼接（小于 100 GB）可以用 Image J 实现。团队自己也编写了 TESOS-Stitcher 软件用于更大规模图像数据的拼接。
图 2. TESOS 透明化包埋方法成像及数据处理流程
利用 TESOS 透明化包埋方法，团队挑战了一项高难度任务——进行完整成年小鼠全身神经均一微米级分辨率的三维成像与重建。带皮肤、带内脏的完整六周龄 Thy1-YFP-16 小鼠（标记全身神经）经处理后变得高度透明。团队利用自改装的带磨削平台的 ASI SPIM 光片显微镜进行成像，同时建立了完整的个性化图像拼接和重建流程，将包含中枢和外周神经系统的小鼠全身神经投射悉数展现在读者眼前。
图 3. TESOS 透明化包埋后利用光片显微镜进行成年小鼠全身神经成像
（双通道拍摄，样本总体积 100×35×20 mm3，总拍摄时长 120 小时，原始数据量约 70TB）
与光片显微镜相比，共聚焦显微镜具有更高的成像分辨率、更好的成像效果，高倍镜下能够获得更多的生物学细节。团队进一步利用 TESOS 透明化包埋结合徕卡共聚焦显微镜 20×/0.95NA 镜头成像，对新生小鼠全身的神经分布进行了亚微米级分辨率的重建。
图 4. 五日龄 Thy1-YFP-16 小鼠全身神经亚微米级分辨率成像及三维重建
图5.五日龄 Thy1-YFP-16 小鼠全身神经亚微米级分辨率成像（头部剖面）
大样本的高质量高分辨率成像是神经投射研究的重要挑战之一。赵瑚教授团队充分发挥 TESOS 透明化包埋的技术优势，利用共聚焦显微镜 40×/1.3NA 镜头，先后完成了小鼠大脑皮层一个 1.5 毫米厚度脑组织块的亚微米级分辨率成像（图 6）（图7为图6中部分细节展示）、包含肌肉和椎骨的小鼠背根神经节及相应的脊髓内感觉神经亚微米级分辨率成像（图 8）、以小鼠前爪为代表的单轴突分辨率外周神经组织成像（图 9、10），并通过病毒标记的手段完成了支配小鼠前爪肉垫的其中 12 个感觉神经元在脊髓内投射的重建及分析（图 11）。
图 6. TESOS 透明化包埋后利用共聚焦显微镜实现 Thy1-EGFP 小鼠大脑神经元亚微米级分辨率成像
图7. 图 6 细节展示
图 8.TESOS 透明化包埋后利用共聚焦显微镜实现 Shh-creERT2;Ai140 小鼠脊髓内感觉神经亚微米级分辨率成像
图 9. TESOS 透明化包埋处理后利用共聚焦显微镜实现 Thy1-YFP-16 小鼠前爪单轴突分辨率成像
图10. Thy1-YFP-16 小鼠前爪单轴突分辨率成像（剖面）
图 11. AAV 稀疏标记的脊髓内感觉神经投射全程成像及重建
最后的终极技术挑战是感觉神经元的全貌重建。一个感觉神经元其外周末梢可以远在指尖，连接的传入神经纤维穿行于各类复杂软硬组织，将承载着感觉信号的电刺激传递到位于脊髓背根神经节的胞体，然后再通过中枢分支投射到脊髓内部。正是由于这样复杂而长的组织结构，哺乳动物的单个感觉神经的全貌从来没有被完整重建。
团队利用成体 Thy1-EGFP 小鼠，进行了皮肤上的感觉神经末梢到背根神经节再到脊髓的跟踪拍摄，绘制了 5 个神经元的完整投射行程，实现了单个神经元从外周到中枢投射重建的技术突破。
图 10. TESOS 透明化包埋与共聚焦显微镜成像重建单个神经元从外周到中枢的完整投射
TESOS 是对传统组织透明化及三维成像技术的一种理念革新。其核心概念在于「透明」和「包埋」。「透明」是 TESOS 与基于超薄切片的大尺度三维成像技术（以 fMOST 为代表）的最大区别。聚合后的良好透明度保证了成像质量，也使得 TESOS 技术与包含光片显微镜、共聚焦显微镜等多种成像系统的有机结合成为可能。TESOS 包埋形成的有机树脂与其他水性透明化技术中的琼脂糖包埋凝胶截然不同，其良好的机械硬度及切割性能大大提高了操作的稳定性，切削（磨削）后样品变形小，数据拼接及重建具有良好的准确性。这一特性使得 TESOS 相较于 ViSoR2（目前多用于大脑样品处理）有更广泛的适用范围，能够同时适用于中枢及外周的处理与成像。
TESOS 透明化包埋处理流程清晰，实验试剂易得，兼容 AAV 标记及免疫荧光染色，在配备有石蜡切片机、共聚焦显微镜的实验室即可实现完整的技术流程，体系灵活性高。TESOS 技术必将成为未来生物医学三维成像的有力工具。
四川大学华西口腔医学院伊亚婷博士、张士文博士、门乙博士、北京脑科学与类脑研究所博士生研究生李有淇为论文的共同第一作者，北京脑科学与类脑研究所赵瑚教授、戈鹉平教授、曲靖医科大学何永文教授为论文的共同通讯作者。
转自：“丁香学术”微信公众号
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