RNA的命运和功能受其结构和相互作用组的影响。然而，RNA和RNA结合蛋白(RBP)如何组装成高阶结构以及RNA分子如何相互作用以促进功能在很大程度上仍然未知。
2024年1月18日，芝加哥大学何川及马萨诸塞大学欧阳正清共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为“KARR-seq reveals cellular higher-order RNA structures and RNA–RNA interactions”的研究论文，该研究提出了KARR-seq，它使用N3-酮醛标记和多功能化学交联剂来共价捕获和确定细胞内RNA-RNA相互作用和高阶RNA结构，独立于局部蛋白质与RNA的结合。
KARR-seq描述高阶RNA结构，并以高灵敏度和准确性检测广泛的分子间RNA-RNA相互作用。使用KARR-seq，该研究发现翻译在自然和胁迫条件下抑制mRNA的压实作用。该研究确定了呼吸道合胞病毒(RSV)和水疱性口炎病毒(VSV)的高阶RNA结构，并鉴定了病毒与宿主RNA之间的RNA-RNA相互作用，这种相互作用可能调节病毒的复制。
另外，2024年1月11日，芝加哥大学何川团队在Molecular Cell 在线发表题为“Sequencing of N6-methyl-deoxyadenosine at single-base resolution across the mammalian genome”的研究论文，该研究提出了一种不依赖抗体直接读取6mA测序(DR-6mA-seq)的方法，以碱基分辨率测量6mA。DR-6mA-seq采用一种独特的基于突变的策略来揭示6mA位点作为错误结合的特征，而不需要任何化学或酶对6mA进行调节。通过在大肠杆菌DNA中成功定位表征良好的G(6mA)TC基序来验证DR-6mA-seq。正如预期的那样，当将DR-6mA-seq应用于哺乳动物系统时，发现基因组DNA (gDNA) 6mA丰度在大多数哺乳动物组织和细胞中普遍较低；然而，研究人员确实在小鼠睾丸和胶质母细胞瘤细胞中观察到不同的gDNA 6mA位点。总之，DR-6mA-seq提供了一种以单碱基分辨率检测6mA的工具，可以全面了解真核生物中的DNA 6mA（点击阅读）。
2024年1月10日，芝加哥大学何川团队在Nature Methods 在线发表题为“Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing”的研究论文，该研究提出了一种基于逆转录的RBP结合位点测序(ARTR-seq)的检测方法，该方法依赖于抗体引导下RBP结合RNA的原位逆转录来识别RBP结合位点。ARTR-seq避免了紫外线交联和免疫沉淀，允许从少至20个细胞或组织切片中高效和特异性地鉴定RBP结合位点。利用快速甲醛固定的优势，ARTR-seq能够在短时间内捕获RBP的动态RNA结合，正如在短至10分钟的时间范围内对应力颗粒组装过程中G3BP1的动态RNA结合的分析所证明的那样（点击阅读）。
2024年1月2日，芝加哥大学何川及戴庆共同通讯在Nature Biotechnology在线发表题为“Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA”的研究论文，该研究提出了超快BS-seq (UBS-seq)，它使用高浓度亚硫酸氢盐试剂和高反应温度将亚硫酸氢盐反应加速约13倍，从而减少DNA损伤和降低背景噪声。UBS-seq允许从少量纯化的基因组DNA构建文库，例如来自无细胞DNA或直接来自1至100个小鼠胚胎干细胞，与传统的BS-seq相比，对5mC水平的高估较少，基因组覆盖率更高。此外，UBS-seq从低输入的mRNA定量绘制RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)，并允许在高度结构化的RNA序列中检测m5C化学计量学。UBS-seq结果确定了NSUN2是主要的“书写”蛋白，负责HeLa mRNA中约90%的m5C位点的沉积，并揭示了哺乳动物mRNA 5 ' -区域中富集的m5C位点，这可能在mRNA翻译调节中具有功能作用（点击阅读）。
RNA主要通过与其他生物大分子，如RNA结合蛋白(RBP)、DNA和其他RNA物种的相互作用而处于基因表达调控的中心。通过涉及交联和免疫沉淀(CLIP)的方法，已经开发出各种方法来研究RNA-RBP相互作用，这些方法显著提高了RNA生物学。然而，RNA如何与其他分子相互作用以及随后的功能后果仍未得到充分研究。RNA的功能通常由其高阶结构决定，包括多个RNA二级结构元件的组装和组织，以及其他生物大分子介导的RNA三维构象。然而，由于这些结构的高度动态性，特别是在对扰动作出反应时，很难确定它们的结构。
基于高通量测序的方法已被应用于揭示RNA-RNA相互作用转录组范围。分子内RNA-RNA相互作用通常对高阶RNA结构的功能相关性至关重要，分子间相互作用可能反映不同的RNA功能。基于Psoralen的方法，如PARIS、RAP-RNA、LIGR-seq、SPLASH和COMRADES，直接捕获RNA双链，并用于研究配对RNA相互作用对RNA代谢的影响。这些方法主要捕获碱基配对相互作用，但可能错过空间近端单链RNA片段之间的距离信息。
蛋白质介导的方法，包括CLASH、RPL、MARIO和RIPPLiT，通过揭示RNA之间的物理距离来补充Psoralen交联，但它们通常对中等表达水平的转录本表现出有限的敏感性，并且主要捕获由特定蛋白质结合的RNA。RIC-seq通过在细胞中进行蛋白质介导的近距离连接，并在连接步骤中加入生物素化核苷酸，提高了灵敏度。然而，由于局部蛋白质浓度和蛋白质- RNA结合的强度在空间上是异质的，因此蛋白质- RNA结合较弱的RNA区域可能未被充分代表。因此，需要开发不完全依赖于蛋白质-RNA交联的技术来研究高阶RNA结构和RNA-RNA相互作用。
KARR-seq绘制高阶RNA结构（图源自Nature Biotechnology ）
该研究描述了酮醇辅助RNA-RNA相互作用测序(KARR-seq)，它利用了N3-酮醇介导的RNA标记和基于树突的核酸构象捕获。N3-酮二醛已被证明可以在活细胞中有效地用叠氮基团标记RNA，作为进一步功能化的生物正交处理。同时，由多个二苯并环辛烷(DBCO)修饰的PAMAM树状大分子可以通过与标记的叠氮基团反应而容易地交联近端RNA转录物。由于KARR-seq使用化学交联剂捕获空间近端转录本，因此KARR-seq检测到的RNA-RNA相互作用并不仅仅由局部蛋白质浓度或RBP-RNA亲和性决定。可以调整交联剂的大小，以捕获不同距离的接近度。KARR-seq还可以富集交联产物，提高对丰度相对较低的转录本的敏感性。
KARR-seq能准确揭示RNA三级结构，识别分子间RNA-RNA相互作用。利用KARR-seq，研究人员发现细胞质mRNA的结构比核mRNA更紧凑，在自然和胁迫条件下，翻译可以解析高阶RNA结构。研究人员检测到RNA-RNA相互作用影响pre-rRNA加工。此外，研究人员绘制了呼吸道合胞病毒(RSV)和水疱性口炎病毒(VSV) RNA的三级结构，并检测了病毒与宿主RNA之间的数百种相互作用。与RSV和VSV相互作用的宿主mRNA丰富了不同的分子途径。阻断RSV RNA与宿主mRNA之间的RNA-RNA相互作用可抑制RSV复制。因此，KARR-seq能够精确和敏感地绘制RNA-RNA相互作用和RNA结构，从而揭示RNA的功能。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41587-023-02109-8
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