Science：V-K CRISPR相关转座酶靶位点选择机制

原文题目：Mechanism of target site selection by type V-K CRISPR-associated transposases

通讯作者：SAMUEL H. STERNBERG

隶属单位：哥伦比亚大学生物化学与分子生物物理系

DOI：10.1126/science.adj8543

V-K CASTs 型 RNA 非依赖性、非靶向整合的机制

V-K 型 CRISPR 相关转座酶 （CAST） 以高效和易于编程的方式催化将大遗传有效载荷插入基因组。然而，这些多组分酶的准确性目前是有限的，这一缺点的根本原因尚不清楚。George 等人。现在表明，V-K 型 CAST 表现出主要由 AAA+ ATP 酶 TnsC 驱动的 RNA 非依赖性整合途径（参见 Dhingra 和 Sashital 的观点）。非靶向转座事件优先发生在富含 A/T 的位点，转座酶 TnsB 识别的序列基序施加了进一步的上下文效应。利用从生化和遗传实验中获得的机理见解，作者调整了细胞中 TnsC 的可用性，并显着提高了整体整合特异性，使精准基因组工程的下游应用成为可能。    

图 1.V-K 型 CAST 指示频繁的 Cas12k 和 RNA 非依赖性转座事件

在没有DNA双链断裂的情况下靶向插入大型遗传有效载荷仍然是基因组工程的主要挑战。CRISPR 相关转座酶 （CAST） 代表了基于核酸酶和引物编辑的方法的一种有前途的替代方案，涉及重新利用核酸酶缺陷的 CRISPR 效应子以促进 RNA 引导的转座。与其他同源系统相比，V-K 型 CAST 具有紧凑的尺寸、易于编程和单向集成特性，因此具有多个潜在的优势。    

图 2.转座的生化重建揭示了靶向和非靶向位点的不同效率

尽管有这些理想的特性，但与I-F型CAST相比，V-K型CAST表现出较差的保真度，并且这种缺乏特异性的分子基础仍然难以捉摸。研究人员合理地认为，确定在靶向与脱靶插入过程中每个 CAST 组分的相对参与，包括向导 RNA 和 Cas 效应子本身，将使研究人员能够解开这种特异性降低的基础。为了实现这一目标，研究人员试图结合生物化学和高通量测序以及生物物理方法来监测转座，以使用荧光和电子显微镜可视化单个转座酶分子。研究人员认为，更深入地了解靶位点选择和转座体组装将为技术工程和改进带来新的机会。    

图 3.RNA非依赖性整合事件发生在优选序列基序处

通过生化和细胞转座实验，研究人员发现来自霍夫曼氏细胞（ShCAST）的代表性CAST系统在独立于Cas12k和引导RNA进行的反应中极易催化非靶向转座。基因缺失实验确定了TnsB、TnsC和TniQ等最小必要机制，冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构揭示了类似于含Cas12k的转座体的BCQ转座体复合物，其中TnsC在定义整体结构中起主要作用。其他生化实验确定 TnsC 是非靶向整合的主要驱动因素，但也表明 TnsB 对 RNA 靶向位点的整合偏好优于非靶向位点。接下来，通过单分子实验和全基因组整合数据的荟萃分析，研究人员发现富含AT的区域是非靶向转座的首选热点，因为TnsC赋予了结合特异性，并且TnsB还施加了局部序列偏差来确定精确的插入位点。对这些基序的了解使研究人员能够将非靶向转座事件引导到用户定义的质粒区域，并且研究人员通过突变关键的DNA链接触残基K103证实了TnsC在介导富含AT的偏好中的作用。最后，研究人员利用 TnsC 在指导非靶向转座方面所起作用的知识来设计改进的 ShCAST 载体，该载体可抑制 RNA 非依赖性转座事件，并将大肠杆菌中 V-K CAST 型特异性提高到 98.1%，而不会影响靶向整合的效率。    

图 5.RNA 引导的 DNA 整合的保真度受 TnsC 浓度控制

该研究结果表明，CRISPR相关转座酶可以表现出RNA引导和RNA非依赖性通路，并且TnsC ATPase在决定靶位点选择中起着重要作用。这两种途径在天然微生物环境中是否活跃仍然未知，尽管研究人员推测非靶向转座可能代表了获得CRISPR-Cas靶向系统之前早期，更原始的转座子生活方式的遗迹。这项工作强调了确定分子机制的重要性，作为利用CAST作为准确的千碱基规模基因组工程工具的新机会。

DOI：10.1126/science.adj8543

转自：“生物医学科研之家”微信公众号

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