原文题目：HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes
通讯作者：Walther Mothes
隶属单位：耶鲁大学医学院微生物发病系
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06762-6
当三聚体 HIV-1 Env 与细胞表面受体 CD4 结合时，HIV-1 开始感染 CD4 T 细胞。CD4 结合诱导 Env 的 gp120 亚基内的构象变化，使辅助受体 CCR5 或 CXCR4 随后参与。受体和共受体结合触发 Env gp41 亚基的构象变化，驱动病毒和宿主细胞膜的融合。最初使用 gp120 核心获得了对 HIV-1 Env 与可溶性 CD4（D1D2 结构域）相互作用的结构见解，然后使用稳定的可溶性 Env 三聚体（含有 S-S 二硫键和 I559P 突变或 SOSIP 的三聚体）。在闭合状态下，变量环路 1 和 2（V1 和 V2）形成环境三聚体的顶点。CD4 结合导致与 CD4 D1D2 结构域对齐的 V1V2 环的大约 40 Å 位移 。从可溶性三聚体中获得的见解已通过使用去垢剂从膜中溶解的全长 Env 蛋白得到证实。通过将共受体CCR5嵌入脂质纳米盘中并确定可溶性gp120，可溶性CD4（D1-D4）和CCR5复合物的结构，可以进一步获得有关Env共受体结合步骤的信息。CCR5 的结合没有诱导 gp120 发生额外的变构变化，而是使 CD4 结合的 gp120 更接近纳米盘模拟的脂质双层。尽管使用 SOSIP 三聚体观察到完全开放和部分开放的 CD4 结合 Env 构象，部分开放的Env三聚体构象是否是真正的中间体尚不清楚。
图 1：使用冷冻电子断层扫描在生物膜中捕获 Env-CD4 相互作用
使用与可溶性受体相互作用的天然膜中的 HIV-1 Env 三聚体，已经获得了对 Env-CD4 相互作用的进一步见解。使用冷冻电子断层扫描 （cryo-ET） 直接对病毒颗粒进行成像，能够表征天然 Env 三聚体和由可溶性 CD4 打开的 Env 三聚体，最初分辨率约为 20 Å，最近在9-10 Å左右。这些结构在很大程度上证实了使用可溶性三聚体和可溶性配体获得的高分辨率Env结构。通过单分子荧光共振能量转移 （smFRET） 分析，可以深入了解病毒颗粒表面 HIV-1 Env 分子的行为，这表明单个 gp120 原生体是动态的，可以自发地进入开放构象状态，包括 CD4 结合状态。只能与一个或两个 CD4 分子结合的工程三聚体表明，Env 开口中必要的中间 FRET 状态对应于不对称三聚体，其中只有一个 CD4 分子与三聚体结合。此外，已观察到一种可溶性三聚体的结构突变阻止开放，仅与单个CD4结合。最后，通过超分辨率定位显微镜与荧光波动光谱成像相结合，研究了活细胞中HIV-1 Env分子与CD4和共受体分子的相互作用。这些数据表明，HIV-1 进入是由 Env 与单个 CD4 结合引发的，随后募集额外的 CD4 分子和共受体分子的二聚体。
HIV-1 Env 三聚体和 CD4 分子之间的相互作用尚未在天然膜中得到结构表征。在这里，研究人员通过冷冻电子断层扫描直接可视化病毒粒子中的HIV-1 Env与天然膜结合的CD4之间的相互作用。研究人员观察到 Env-CD4 复合物聚集并组织成环，并且聚集的模式与界面处膜之间距离的减小相关。断层扫描平均和分类显示，当膜相距较远时，Env 三聚体与单个 CD4 分子结合。当相对的膜相互接近时，Env三聚体与两个或三个CD4分子结合。V1V2环在CD4结合的原生体中向外投射，而未结合的原生体则表现出异质构象状态。这些数据表明，在病毒与膜结合期间，具有一个和两个结合的 CD4 分子的不对称 HIV-1 Env 三聚体是可检测的中间体。
图 2：HIV-1 Env 与 CD4 的结合诱导 Env 聚集并在膜-膜界面形成环
在这里，研究人员使用冷冻电子断层扫描来可视化HIV-1进入的初始步骤，其中Env三聚体与驻留在靶膜中的CD4受体分子结合。混合HIV-1BaL的具有 VLP 呈递 CD4 受体的病毒粒子提供了一个实验系统，可产生高频率的 Env-CD4 复合物，使研究人员能够使用冷冻电子断层扫描定量研究它们在生物膜中的相互作用。研究人员观察到HIV-1 Env三聚体在膜-膜界面处形成簇和环。随着膜-膜界面处膜间距离的减小，与越来越多的CD4分子结合的Env结构变得可见。这表明这些图像代表了动态逐步绑定过程的快照。
Env在膜-膜界面处的簇状和环状分布与SNARE蛋白在突触囊泡膜对接位点的组织高度相似。在膜-膜界面处观察到的 Env-CD4 复合物的模式可能是简单粘附的结果。然而，SNAREs 和 HIV-1 Env 三聚体都是最终将膜聚集在一起进行融合的融合机器，这表明这些观察结果与融合有关。
混合病毒颗粒系统使研究人员能够以高频可视化含有 Env-CD4 复合物的膜-膜界面。获取 168 张断层图使研究人员能够识别 857 个膜-膜界面，其中包含大约 5,700 个 Env-CD4 复合物，用于断层扫描平均和随后的分类。研究人员的综合分析表明，当两个膜相距较远时，HIV-1 Env 三聚体会与单个 CD4 结合，当 Env 靠近膜时，HIV-1 Env 三聚体会与第二个和第三个 CD4 结合。与一个和两个 CD4 分子结合的 Env 三聚体的构象状态是不对称的，不仅与 CD4 结合的固有不对称性有关，而且与三聚体内每个原生体的构象状态有关。研究人员的冷冻电子断层扫描密度图的分辨率足够高，可以识别出 V1V2 环在所有 CD4 结合的原聚体中向外突出，与驻留在 CD4 结合构象中的原聚体一致。在Env三聚体的未结合原体中，V1V2环的密度定义较少，其中有一个或两个结合的CD4分子表明不同的构象状态。目前冷冻电子断层扫描可以实现的分辨率限制将不允许研究人员解析 V1V2 环在顶点的位置，这对于 1b 级分离株也是已知的高度动态的。所附报告描述了一个模型，其中 V1V2 环位于这些原型中的三聚体顶点。采用冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）解析了可溶性BG505 SOSIP三聚体与1个和2个CD4分子结合的高分辨率结构。在两个 CD4 分子与 Env （BG505 HT2） 结合的模型中，CD4 结合的原型体采用典型的 CD4 结合构象，V1V2 环从 Env 顶点移位到 gp120 的侧面，具有完全形成的四链反平行桥接片。相比之下，未绑定的 gp120 通过全身旋转移动，但 V1V2 环保持在三聚体顶点，采用封闭的开放构象。可溶性 BG505 HT2 模型与两个 CD4 分子结合非常适合研究人员使用冷冻电子断层扫描观察到的密度。文献中，BG505 HT1 三聚体与一个 CD4 分子结合的主要结构是封闭的三聚体。而是研究人员生物膜中的开放三聚体。但是，随附报告中的子分类结果表明，与一个 CD4 结合的 BG505 HT1 三聚体中约有三分之一采用开放三聚体构象，该构象很好地叠加到与一个 CD4 分子结合的 Env 冷冻电子断层断层断层结构上。因此，两个实验室的结果是一致的，特别是因为已知对 CD4 耐药性更强的 2 级 HIV-1 分离株（如 BG505）对 CD4 的反应不如 1b 级分离株 HIV-1BaL的用于冷冻电子断层扫描。冷冻电子断层扫描和冷冻电镜SPA测定的相似结构表明，在CD4受体结合过程中存在不对称的Env中间体。
图 3：断层扫描平均和分类显示 HIV-1 Env 三聚体与一个、两个和三个 CD4 受体分子结合的中间体。
研究人员小组先前进行的smFRET研究预测了三聚体开口存在不对称性。被设计为仅与一个 CD4 分子结合的三聚体具有相邻的未配体原体，其中间构象状态与未结合和 CD4 结合的构象不同。此外，smFRET表明HIV-1 Env可以自发地进入这种中间构象状态，并且其占有率在CD4结合下增加。这些协议带来了希望，即平行冷冻电镜和smFRET研究可以解决有关两种方法观察到的Env状态的剩余未知问题。一个悬而未决的问题涉及smFRET预测的病毒粒子表面HIV-1 Env的额外构象状态。这种状态很脆弱，并受到温和治疗的影响，包括 AT-2 灭活。由于 AT-2 处理的病毒颗粒在融合过程中沿着 Env 构象转变的路径，因此它们在与 CD4 受体结合并与细胞融合的能力方面没有缺陷，这种未知的构象状态可能是本报告中研究的与CD4相互作用的上游。
检测与一个和两个 CD4 分子结合的不对称 HIV-1 Env 三聚体表明，这些中间体非常常见且寿命长，这可能对抗体介导的免疫反应和疫苗免疫原设计产生影响。本研究报告和所附报告揭示了一种三聚体开放机制，该机制通常通过将 V1V2 环保持在顶点顶部来维持免疫逃避原理，从而阻碍非中和抗体获得表位。然而，最近已经发现了与这些部分开放的构象状态结合的抗体，这表明这些中间体上的 V1/V2 表位可能被免疫系统识别。
图 4：MDFF 分析表明，与三个 CD4 分子结合的 Env 三聚体处于部分开放的构象中。
研究人员在这份报告和所附报告中的研究指向HIV-1与CD4受体结合的逐步模型。HIV-1病毒粒子和细胞之间的初始接触是通过单个原生体与细长的CD4受体分子结合介导的，此时膜彼此之间仍相距约20 nm。第二个和第三个 CD4 分子的结合使 HIV-1 Env 能够更接近靶膜。CD4 内的构象变化促进了这种运动，其中 D3D4 结构域与靶膜对齐。然而，即使有这些构象变化，与三个 CD4 分子结合的 Env 三聚体仍然太远而无法与膜包埋的共受体结合。gp120-CD4相互作用中存在相当大的空间限制，必须克服这些限制才能使Env三聚体与共受体结合。这可以通过 gp120 过渡到共受体时释放 CD4 或靶细胞中的膜弯曲来实现。未来将CCR5嵌入靶膜的实验将揭示共受体结合和随后形成的前发夹中间体。这里描述的实验系统可能有助于表征HIV-1进入过程的这些后续步骤。
转自：“生物医学科研之家”微信公众号
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