原文题目：A Glycolipidated-liposomal peptide vaccine confers long-term mucosal protection against Streptococcus pyogenes via IL-17, macrophages and neutrophils
通讯作者：Manisha Pandey
隶属单位：格里菲斯大学糖组学研究所
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-41410-7
A组链球菌（化脓性链球菌）感染及其后遗症是发病和死亡的重要原因。包括急性风湿热（ARF）和风湿性心脏病（RHD）在内的化脓性链球菌相关疾病的全球死亡率估计每年超过500,000例死亡。化脓性链球菌定植于上呼吸道（URT）和皮肤的上皮表面，从那里可以进展为侵袭性和免疫介导的疾病。估计每年有 616.111 亿例化脓性葡萄球菌性咽炎和 。亿例化脓性葡萄球菌性脓皮病发病率。侵袭性链球菌病，包括链球菌中毒性休克综合征，死亡率为 7-23%。
迫切需要疫苗。但是，有两个主要障碍。首先，ARF和RHD的病理生理学被认为是由化脓性链球菌抗原与人组织交叉反应之间的自身免疫分子模拟驱动的。已在蛋白质的 B 重复区鉴定出 M 蛋白交叉反应表位。其次，抗原菌株变异广泛，从而挑战甚至多价疫苗方法。疫苗开发的最小保守表位方法解决了这两个问题。
图1：J8-Lipo-DT和J8-Lipo-DT-PHAD的理想化示意图和免疫原性和有效性
我们从M蛋白的高度保守的C8重复区域定义了一个隐秘的B细胞表位J3。J8可以与载体蛋白（如白喉类毒素（DT）或交叉反应材料-197（CRM））偶联，使其在远交种群中具有免疫原性。接种J8-DT佐剂明矾可预防皮肤病，J8-DT/明矾在自身免疫性瓣膜炎大鼠模型中均被证明是安全的和免疫原性的并在随机试点临床试验中。然而，这种疫苗对链球菌粘膜感染没有保护作用。使用免疫显性但多形性氨基末端 M 蛋白表位进行肠外免疫可诱导 URT 免疫，但需要能够在URT中诱导菌株超越免疫的疫苗。接种含有J8的脂质体或含有密切相关肽J14的蛋白酶体，导致短期黏膜 IgA 反应和对激发性感染的保护。然而，免疫的相关性尚未定义，需要提高免疫水平和持久性的策略来经验设计候选疫苗。
人们普遍认为 IgA 负责粘膜保护。事实上，M蛋白特异性的IgA，而不是IgG，可以为小鼠提供被动的粘膜免疫。M蛋白特异性人IgA降低链球菌对咽细胞的粘附。然而，这些研究并不排除链球菌免疫的其他机制的重要作用。结果表明，链球菌粘膜感染导致脾细胞产生白细胞介素（IL）−6和IL-17，并且来自IL-4功能小鼠的CD17 T细胞，但不是来自IL-17缺乏的（Il17+−/−）小鼠，可以被动地将某些小鼠的抗性转移到粘膜感染。
图2：J8-Lipo-DT-PHAD诱导的Th17细胞
先天免疫在防御化脓性链球菌方面也很重要。与未耗竭的对照相比，化脓性链球菌感染早期巨噬细胞的消耗导致小鼠存活率降低。巨噬细胞的缺乏也与细菌向血液和内脏器官的传播有关。缺乏肿瘤坏死因子（TNF）的小鼠未能将巨噬细胞募集到感染部位，但不能募集多形核白细胞（PMN），并且容易受到化脓性链球菌的挑战。巨噬细胞可以被T细胞激活并提供非调理吞噬作用，它们还可以与抗体一起工作，以提供针对感染性生物体的调理吞噬作用。巨噬细胞已被证明在抗体依赖性 J8-DT 介导的皮肤保护中起重要作用。因此，它们在先天性和适应性免疫中都起着关键作用。
为了提高疫苗诱导的粘膜免疫力，我们询问了Toll样受体4（TLR4）激动剂是否会增加疫苗介导的保护水平和持久性。TLR4激动剂广泛用于现代疫苗中，以增加辅助T-T-1反应并扩大诱导的抗体类别。据报道，它们还可以增强Th17的反应。3D（6-酰基）PHAD（PHAD;也称为GLA）是解毒单磷酰脂质A（MPLA）的合成类似物。MPLA是一种TLR4配体，包含明尼苏达州沙门氏菌R595脂多糖（LPS;内毒素）的脂质A部分。TLR4 刺激导致髓系分化因子 88 （MyD88） 信号传导和 NF-κB 的激活以及促炎细胞因子（如 TNF）的下游表达， IL-6， IFN-γ和 IL-17。这些细胞因子的表达通过刺激抗原呈递细胞（APC）的成熟来增强适应性免疫应答。MPLA已被用于人类疫苗试验，其中它被证明可以增强抗体反应和多功能T细胞反应。它成功地与脂质体悬浮液一起用于葛兰素史克适用于人类的输送系统AS01。它在儿童和婴儿中显示出有希望的安全性和有效性，并且是许可疫苗配方的一部分。TLR4激活佐剂诱导或增强粘膜IgA反应的能力已在两项研究中得到证实。在第一项研究中，设计了一种脂质体疫苗结构，以在其表面表达化脓性链球菌疫苗抗原J8和甲型流感病毒抗原M2e。该疫苗在加入 PHAD 的情况下进行了佐剂。这种组合疫苗能够诱导IgA反应并保护小鼠免受两种病原体的侵害。第二项研究表明，鼻内递送TLR4激活佐剂（GLA-SE）可将肺部CD4 T细胞反应从Th1转换为Th17主导的组织驻留反应。
图3：用J8-Lipo-DT-PHAD和J8-Lipo-DT免疫后免疫反应的寿命和保护效果
在这里，我们描述了一种自佐剂粘膜疫苗递送系统，该系统由脂质体封装DT作为T细胞帮助的来源并显示脂质化的J8（以促进插入脂质体膜）组成，并评估PHAD增强免疫力的能力。我们测试疫苗介导的抗体和细胞记忆反应的持久性，并使用基因敲除小鼠和耗竭研究来评估抗体和适应性细胞反应在 PHAD 疫苗介导的粘膜免疫中的作用。
这里提供的数据显示，鼻内注射含有肽抗原J8和免疫刺激糖脂PHAD的脂质体疫苗能够诱导细胞和体液免疫反应。化脓性链球菌鼻内增强导致疫苗接种后 1 年以上抗体和细胞因子的记忆反应。然而，尽管诱导了强烈的IgA抗体反应，但接种疫苗的小鼠缺乏粘膜IgA和IgG（pIgR−/−小鼠）或总抗体（μMT小鼠）在化脓性链球菌URT攻击后受到保护。与接种疫苗的野生型对照相比，缺乏粘膜抗体的接种疫苗的小鼠分泌IL-17A水平显着更高。此外，缺乏IL-17A的接种疫苗的小鼠在化脓性链球菌URT感染后不受保护，这表明IL-17A的作用又受到巨噬细胞和中性粒细胞的“调节”。
图4：用于评估疫苗诱导抗体功能的预孵育激发试验
CD4 T+.RM细胞定位在感染部位，并对细菌感染产生快速和靶向的免疫反应。它们作为皮肤肺等组织部位的前线，并驱动在第一次接触病原体时产生的第一波效应细胞。已经表明，这些细胞对针对肺炎克雷伯菌感染的初始反应至关重要，并且来源于失去其特征细胞因子IL-17A表达的exTh17细胞。人类和小鼠中组织记忆CD69和CD4 T细胞对CD8的特异性上调表明，在组织部位分化的记忆T细胞识别与血液中循环的信号不同的信号。虽然 CD8 T。RM在粘膜部位内还具有αE整合素CD103的上调，CD103对CD4 T的作用+.RM不太清楚，因为许多 CD4 T+.RM在小鼠和人类中不表达CD103。与这些研究一致，我们观察到CD4 T+.RM的比例较低。在肺中表达CD103（<10%）的细胞。CD103的区室化增加−CD69 CD4 T+.RM接种J8-Lipo-DT-PHAD的小鼠肺部细胞提供了证据，证明我们的疫苗设计诱导了最佳T.RM反应。我们还观察到，与PBS和其他缺乏J8，DT或PHAD的疫苗配置相比，用J8-DT刺激离体的J17-Lipo-DT-PHAD免疫小鼠的肺细胞具有显着更多的IL-4CD17（Th17）细胞，因此IL-8A分泌显着更高。这些发现表明，接种J8-Lipo-DT-PHAD可诱导J8-DT-特异性T++.RM和Th17细胞，有助于诱导URT的长期免疫。接种J8-Lipo-DT-PHAD的小鼠能够以J17-DT，J8和DT依赖性方式诱导IL-8A分泌，这显着高于测试的所有其他疫苗配置。
图5：体液反应在J8-Lipo-DT-PHAD介导的保护中的作用
与IL-17A的作用一致，我们观察到在感染前从接种疫苗的小鼠中去除CD4 T细胞或巨噬细胞和中性粒细胞（单独或两次耗尽）使它们无法控制感染。IL-17已被证明可以激活巨噬细胞是细菌感染中吸引中性粒细胞的趋化因子（如CXCL1和CXCL2）的重要来源。由组织驻留巨噬细胞产生的CXCL1协调中性粒细胞趋化性进入组织部位。因此，巨噬细胞的消耗将消除免疫力，因为中性粒细胞不会被吸引到感染部位。同样，中性粒细胞的消耗也会由于缺乏对化脓性链球菌的视索细胞杀伤而取消免疫力。
先前的数据显示，肌肉注射J8-DT / Alum的小鼠的抗体可以将对皮肤感染的保护转移到幼稚的接受者身上。在这里，我们表明J8-Lipo-DT-PHAD诱导的抗体具有功能性并且可以预防感染，但细胞反应是关键和充分的。化脓性链球菌感染的主要部位是URT和皮肤。单独使用J8-DT/明矾进行肠外疫苗接种不足以提供对粘膜链球菌感染的保护。然而，我们在这里表明，粘膜疫苗接种策略可以诱导局部保护性免疫，并且PHAD起着增强作用。利用TLR4或Myd88敲除小鼠模型来评估PHAD在疫苗介导的免疫中的作用将进一步支持这些发现。
图6：IL-17和CD4 T细胞在J8-Lipo-DT-PHAD介导的保护中的作用
MPLA/PHAD的佐剂活性主要归因于其激活巨噬细胞和诱导细胞因子级联的能力。募集的巨噬细胞可以防止化脓性链球菌从感染部位扩散到血液和内脏。此外，IL-17A 的缺失与感染部位的中性粒细胞募集减少和化脓链球菌清除率显着减弱有关。在本文中，我们证明了巨噬细胞和中性粒细胞在疫苗诱导免疫中的关键效应功能。
接种疫苗后1年多后，即用化脓链球菌增强，导致与用J8-Lipo-DT免疫的小鼠相比，J8-Lipo-DT-PHAD免疫小鼠的抗体反应显着增加。与PBS相比，接种J17-Lipo-DT-PHAD的小鼠的肺和脾脏中的IL-8A显着增加。IL-17A已被证明在化脓性链球菌免疫中起重要作用。化脓性链球菌复发性 URT 感染与 IL-17A 以 TGF-β1 和 IL-6 依赖性方式上调有关。Fan等人，2014年表明，用化脓性链球菌细胞壁结合蛋白Sortase A接种霍乱毒素B亚基（一种非人类顺应性佐剂）佐剂，导致NALT中的CD4和IL-17A细胞增加。与这些报告一致，我们发现缺乏IL-17A的小鼠没有受到疫苗接种的保护。
多种鼻内化脓性链球菌候选疫苗已证明与抗原特异性唾液 IgA 和 URT 保护有关。分泌型 IgA 的主要功能是阻止机会性病原体浸润黏膜上皮屏障。这个过程被称为免疫排斥。一项早期研究表明，M6蛋白特异性）sIgA能够阻断粘膜表面的粘附，IgG能够阻断导致侵袭的表位。我们还表明，M蛋白（p145，包含J8序列）中保守区域肽的粘膜IgA特异性能够在体外调理化M5化脓性链球菌。在这里，已使用 pIgR 评估了 sIgA 和粘膜 IgG 对 J8-Lipo-DT-PHAD 介导的免疫的必要性−/−小 鼠。我们出乎意料地观察到，接种了pIgR疫苗。−/−与链球菌攻击后组织中的PBS小鼠相比，小鼠的细菌负荷显着降低，表明sIgA对J8-Lipo-DT-PHAD诱导的免疫不是必需的。sIgA 对某些细菌和病毒性粘膜病原体在粘膜免疫中的重要性一直存在争议。这些包括流感病毒、轮状病毒，福氏志贺氏菌和幽门螺杆菌。然而，我们的数据并未显示IgA（和IgG）不能在J8-Lipo-DT-PHAD诱导的链球菌免疫中发挥作用，而是表明粘膜抗体所起的任何作用都取决于CD4 T细胞的存在，CD8 T细胞可能作为遗忘抗体反应的辅助细胞，但也作为巨噬细胞的激活剂。我们之前表明，特异性IgG可以介导对皮肤和腹膜内感染的保护。CD4 T细胞在该模型中的免疫中发挥作用。我们观察到，在激发前CD4 T细胞的耗竭导致小鼠在激发后无法维持J8特异性抗体滴度，从而导致存活率降低。
图7：组织驻留记忆（T.RM）接种疫苗的小鼠肺部的细胞
总之，我们的数据表明，CD4 T细胞对J8-Lipo-DT-PHAD诱导的粘膜免疫至关重要，与通过IL-17激活巨噬细胞和中性粒细胞的主要作用一致，并且可能在增强化脓性链球菌暴露后的疫苗特异性抗体。在疫苗中加入PHAD可以实现保护性细胞反应以及长寿命的功能抗体。不含PHAD（J8-Lipo-DT）的疫苗虽然具有保护作用，但不能依赖于涉及IL-17A或IL-2的细胞免疫机制，这些机制可显着保护宿主免受感染。因此，纳入PHAD大大拓宽了疫苗接种后可用的保护机制。
图8：巨噬细胞和中性粒细胞耗竭后J8-Lipo-DT-PHAD介导的保护
我们证明，当将TLR4激动剂PHAD纳入脂质体鼻内链球菌疫苗时，可显着增强细胞和体液免疫反应和保护水平。含PHAD疫苗的持久保护是通过CD4 T细胞，IL-17A，巨噬细胞和中性粒细胞介导的，独立于抗体起作用。疫苗诱导的抗体以低滴度存在，具有功能性，可能有助于与巨噬细胞和中性粒细胞一起作用的整体免疫水平。总之，这些数据突出了含PHAD的脂质体疫苗诱导的对化脓性链球菌的粘膜免疫的不同互补机制的复杂相互作用。这种疫苗平台能够在粘膜中诱导细胞和体液免疫反应，可以广泛适用于其他粘膜病原体。
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