背景：
过氧化物酶体是重要的代谢细胞器，通过移动受体从细胞质中输入它们的管腔(基质)酶。令人惊讶的是，受体甚至可以输入折叠的蛋白质，但其潜在的机制一直是个谜。最近的研究结果揭示了输入受体如何将货物运送到过氧化物酶体中。货物结合受体从细胞质中穿过过氧化物酶体膜完全进入基质，其机制类似于通过核孔的运输。然后受体通过一个单独的逆转录通道返回细胞质，将货物留在细胞器内。这个循环将输入的蛋白质集中在过氧化物酶体内，而货物输入的能量由受体输出提供。因此，过氧化物酶体蛋白质的输入与其他已知的跨膜转运蛋白质的机制有着根本的不同。
简介：
2023年9月22日，来自美国哈弗医学院的Tom A. Rapoport教授课题组在Trends in Cell Biology（IF: 19.0）杂志上发表题为“Towards solving the mystery of peroxisomal matrix protein import”的文章[1]。
主要结果：
蛋白质导入过氧化物酶体的概述。
大多数过氧化物酶体基质蛋白含有一个称为PTS1的过氧化物酶体靶向信号，该信号位于其C端，由氨基酸序列Ser-Lys-Leu (SKL)或其变体组成。这个信号在细胞质中被可溶性受体PEX5识别。PEX5由一个长而非结构化的N端区域和一个球状四肽重复(TPR)结构域组成。TPR结构域直接与PTS1肽结合。货物结合的PEX5通过包括保守膜蛋白PEX13和PEX14的复合体被募集到过氧化物酶体上。然后受体通过PEX13形成的导管将货物运送过氧化物酶体膜。PEX5通过PEX14的管腔结构域与受体n端基序之间的相互作用被驱动到基质中。这些基序的特征是氨基酸序列WxxxF/Y(其中“x”表示任何残基)，并且在所有已知的过氧化物酶体输入受体中以不同的数量存在。
PEX5通过PEX13形成的导管穿过细胞膜。
长期以来，人们一直认为PEX13对过氧化物酶体基质蛋白的进口至关重要，尽管它的作用直到最近才清楚。PEX13的标志是一个YG结构域，这是一个固有的非结构化区域，富含芳香和小氨基酸，主要是酪氨酸(Y)和甘氨酸(G)。这些不寻常的序列特性最初被多个研究小组注意到。尽管总体序列保守性较低，但它们仍被保存下来，足以识别远亲的PEX13同源物。酪氨酸尤其重要，因为在酵母中将其突变为丝氨酸会消除基质蛋白的输入。有趣的是，如果存在足够数量的酪氨酸，那么酪氨酸的确切位置并不重要。YG结构域位于PEX13的N端附近，后面是一个长两亲螺旋(AH);一些物种(如绿藻)在AH的下游含有第二个YG结构域。在opisthokonts(即真菌和动物)和一些原生动物的PEX13中也存在一个跨膜(TM)片段和一个Src同源3 (SH3)结构域，但其他部分并不普遍保守。
过氧化物酶体易位。
由多个YG结构域形成的网状结构被证明在体内通过二硫化物介导的交联发生在过氧化物酶体上。通过将单个半胱氨酸引入酵母PEX13的YG结构域，并用氧化剂处理相应的膜，观察到该蛋白的高效二聚化。引入两种半胱氨酸揭示了低聚物形式的阶梯，与YG结构域组装成密集的多价网络一致。将YG结构域的保守酪氨酸突变为丝氨酸导致网络崩溃，从而取消了输入。
YG网被相反方向的PEX13分子悬浮在过氧化物酶体膜上。这种双重拓扑结构在膜蛋白中是一种不寻常的特性。通过在酵母蛋白的两端加入特定的蛋白酶裂解位点，证明了PEX13的结构。只有一半的PEX13分子可以被蛋白酶接近，因此裂解位点面对细胞质。二硫化物介导的交联进一步证明了两个种群的YG结构域相互关联。因此，PEX13的双重拓扑结构解释了YG结构域如何在膜内相遇，形成跨越脂质双分子层的网络。在藻类PEX13的情况下，AH两侧的两个YG结构域可能也在膜内相遇。
提出的核孔样转座子与其他模型的比较。
最近的一项研究表明，PEX13易位子仅在货物易位期间组装。这一结论是基于活酵母细胞的荧光相关光谱(FCS)实验得出的，该实验表明，PEX13在过氧化物酶体表面的小斑块中与进入的货物短暂重合。然而，尚不清楚观察到的巧合是否反映了PEX13的实际聚集性，还是更保守的解释，即进入的货物必然与转座子有关。尽管PEX13易位子可能由数量可变的亚基组成，但它们似乎不太可能在每次易位事件中重新组装。由于PEX13的亲水表面会与疏水脂质接触，因此预计其AH不会作为单体跨越膜。事实上，通过二硫化物介导的交联，大多数PEX13在稳定状态下被证明是低聚的，这与早期支持PEX13低聚的数据一致。在酵母中主要的输入受体PEX5缺失的情况下，YG结构域也形成低聚物并组装成一个网络，尽管不能轻易排除其他输入受体的可能作用。无论如何，通过电子显微镜对PEX13孔隙的明确可视化仍然缺乏。
PEX5在基体中的偏扩散。
PEX5通过YG网络的扩散原则上应该是双向的，类似于核转运受体在核孔内穿越FG网络的方式。核转运的方向性是由核质和细胞质之间的Ran•GTP/GDP梯度确定的。相反，过氧化物酶体依赖于基质内PEX5和PEX14之间的相互作用来偏向向内扩散。PEX5的WxxxF/Y基序以高亲和力结合PEX14的N端结构域，目前已确定PEX14面向基质。这种相互作用可能被增强，因为PEX5蛋白通常含有多个WxxxF/Y基序，而PEX14形成低聚物。与PEX14的有利相互作用将胜过与YG网络的低亲和相互作用，从而将PEX5从管腔侧的网络中驱逐出去。在酵母中，PEX5与其他进口成分(如PEX13或PEX8)之间的管腔相互作用可能进一步偏向向内扩散。
PEX5完全进入基质。
虽然人们早就知道PEX5在导入过程中进入基质，但该受体是否完全进入过氧化物酶体一直存在争议。最近的数据表明，整个PEX5分子，而不仅仅是WxxxF/Y基序或cargo-binding domain，在导入过程中通过矩阵传递。得出这一结论的关键是一种新的无细胞系统，该系统再现了爪蟾卵提取物中基质蛋白的输入。该系统允许PEX5被在不同位置(N端，中间端或C端)含有过氧化物酶体基质蛋白酶裂解位点的突变体所取代。所有的突变体都被证明是断裂的，这表明整个PEX5分子都进入了基质。一个类似的策略最初被用来证明在哺乳动物细胞中受体的N端进入管腔。蛋白酶保护实验加强了PEX5完全进入管腔，并与先前的研究一致，证明PEX7 (PTS2-cargo适配器)也进入基质。
PEX5通过泛素连接酶复合体循环。
为了从基质返回到细胞质中，PEX5必须再次穿过膜。在非洲爪蟾系统中，通过蛋白酶保护实验获得了这一步骤可能发生的线索，该实验确定了PEX5在跨膜方向上的一个突出的逆转录中间体。在这种状态下，PEX5的前20-30个氨基酸可以被外源添加的蛋白酶接近，因此面向细胞质，而其余的，包括C端折叠的TPR结构域，被保护免受蛋白质水解，因此位于基质内。重要的是，这种跨膜状态的丰度通过突变回收所需的受体的保守半胱氨酸而增加，表明这种状态对应于停滞的回收中间体。先前在大鼠肝脏过氧化物酶体中描述了具有类似取向的PEX5中间体。
通过免疫沉淀中间体和质谱分析结合蛋白，揭示了反转录转座子的身份。主要的相互作用伙伴是PEX2-10-12泛素连接酶复合物的所有三个组成部分。通过突变PEX5 N端非结构化区域的保守两亲螺旋(AH2)，破坏了与连接酶的相互作用。在没有这个螺旋的情况下，PEX5被困在了基质中。类似地，缺乏AH2区域的PEX5突变体已被证明可以进入大鼠肝脏过氧化物酶体，但不能返回细胞质。因此，AH2是PEX5的输出信号，允许受体N端，包括保守的半胱氨酸，出现在细胞质中进行单泛素化。PTS2货物的受体可能使用相同的机制，因为它们具有与PEX5相似的特征，并且通过类似的蛋白酶保护的回收中间体。
与其他蛋白质转运系统相比，过氧化物酶体蛋白质输入。
转运到过氧化物酶体最类似于核运输。在这两种情况下，移动受体通过一个选择阶段运送折叠的货物，该阶段由非结构化蛋白质结构域形成，并通过芳香残基之间的内聚相互作用保持在一起。然而，一个重要的区别是，过氧化物酶体期位于膜内，形成一个与周围脂质隔绝的水导管，而核孔期悬浮在核质和细胞质之间的水空间中。过氧化物酶体期也可能比核孔期更致密。然而，过氧化物酶体输入和核运输之间的相似性提出了蛋白质如何靶向到正确的隔室的问题。核转运受体含有大的球状结构域，与苯基丙氨酸的相互作用比酪氨酸更强，因此对过氧化物酶体的亲和力较低，并且在空间上也会阻碍其扩散。相比之下，PEX5确实进入细胞核并主动输出。
结论和展望：
阐明过氧化物酶体基质蛋白输入的机制揭示了两种蛋白质跨膜移动的新途径。最近的进展已经澄清了折叠蛋白质如何转运到过氧化物酶体的长期问题，并导致了对该途径的更全面的理解。许多问题仍未解决，这些问题肯定会引导未来对这一迷人话题的研究。至关重要的是，这种机制的洞察力将有助于阐明重要成分的突变如何引起疾病，并有望加速适当治疗方法的开发。
原文链接：
https://www.cell.com/trends/cell-biology/pdf/S0962-8924(23)00169-1.pdf
参考文献：
[1] Skowyra ML, Feng P, Rapoport TA. Towards solving the mystery of peroxisomal matrix protein import. Trends Cell Biol. 2023 Sep 22:S0962-8924(23)00169-1. doi: 10.1016/j.tcb.2023.08.005. Epub ahead of print. PMID: 37743160.
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