来源《微生态》公众号。
导读
槟榔碱是从槟榔中提取的一种生物碱，具有多种药理作用。本研究发现槟榔碱加重了葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠实验性急性溃疡性结肠炎(UC)。本研究测量了小鼠体重和结肠长度，评估了疾病活动指数、结肠病理切片和结肠炎症因子水平。槟榔碱加重了小鼠UC的临床症状和结肠炎症反应。粪便样本的16S rRNA测序结果显示，在槟榔碱处理后，益生菌Ligilactobacillus、Limosilactobacillus和乳杆菌属(Lactobacillus)的百分比显著降低，条件致病菌Odoribacter和拟杆菌属(Bacteroides)的百分比显著增加。血清非靶向代谢组学结果显示，槟榔碱干预降低了麦角硫因、喷司他丁、四磷酸二腺苷等代谢物的水平，并调节了肠道微生物的烟酸和烟酰胺代谢、代谢途径、乙醛酸和二羧酸代谢等代谢途径。根据微生物和代谢物的综合分析，槟榔碱通过调节肠道微生物群来影响代谢物水平。综上所述，本研究发现槟榔碱加剧了UC小鼠的结肠损伤和肠道炎症反应，破坏了宿主肠道菌群，影响了菌群代谢产物的变化，从而加剧了结肠炎症的发展。因此，食用槟榔可能与加重UC风险有关。
论文ID
原名：Arecoline aggravates acute ulcerative colitis in mice by affecting intestinal microbiota and serum metabolites
译名：槟榔碱通过影响肠道菌群和血清代谢物加重小鼠急性溃疡性结肠炎
期刊：Frontiers in Immunology
IF：7.3
发表时间：2023.7
通讯作者：刘丹，易波
通讯作者单位：南昌大学药学院；江西省肿瘤医院
DOI号：10.3389/fimmu.2023.1197922
实验设计
结果
1 槟榔碱对小鼠结肠炎临床症状的影响
本研究用3% DSS溶液诱导小鼠结肠炎，建立UC模型，以研究槟榔碱对结肠炎的影响。研究小组的详细情况如图1A所示。通过测量三组小鼠的结肠长度，发现DSS组的小鼠结肠长度比对照组短(P<0.01)；然而，Arec组的结肠缩短更为严重(P<0.001)(图1B, C)。在体重减轻方面，在第14天，槟榔碱组与对照组之间的体重有显著差异(P<0.01)；此外，槟榔碱加剧了DSS组小鼠的体重减轻(图1D)。使用DAI评分来分析所有小鼠的体重变化和粪便特性(便血和粪便稠度)，结果表明，槟榔碱加重了DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎的临床症状(图1E)。
图1. 槟榔碱对DSS诱导的UC小鼠临床症状的影响。(A)小鼠UC模型的建立及槟榔碱处理。(B) Arec组、DSS组和对照组小鼠结肠的代表性图像。(C)小鼠结肠长度。(D)实验期间三组小鼠的体重变化情况。(E)三组小鼠的疾病活动指数。P＜0.05具有统计学意义：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
2 槟榔碱对小鼠结肠炎症反应的影响
通过结肠切片H＆E染色观察到，对照组结肠结构完整，DSS组结肠结构破坏严重，隐窝破坏，腺体消失，肠道结构破坏更严重，出现肠道炎症。Arec组比其他两组显示出更多的中性粒细胞聚集(图2A)。ELISA结果显示，Arec组结肠组织中炎症因子IL-6 (P<0.001)、TNF-α (P<0.001)和IL-1β (P<0.001)的水平显著高于DSS组(图2B-D)。
图2. 小鼠结肠组织病理切片及炎症因子变化。(A)小鼠结肠组织的H&E染色图像(40×，200×)。(B-D) DSS组和Arec组小鼠结肠组织中炎症因子(包括TNF-α、IL-6和IL-1β)的浓度。P＜0.05具有统计学意义，***P＜0.001。
3 槟榔碱对肠道微生物群的影响
研究表明，肠道微生物群与消化、吸收、代谢、免疫等功能有关，肠道菌群失调与肿瘤、腹泻、肥胖、心脑血管疾病等多种疾病的发生密切相关。据报道，肠道菌群平衡的破坏也与UC的发展有许多联系。因此，为了研究槟榔碱和DSS对肠道菌群的影响，本研究对三组小鼠粪便样本进行了16S rRNA测序，并分析了小鼠肠道微生物群的α和β多样性指数。根据Shannon、Simpson和ACE指数，与DSS和对照组相比，Arec组的肠道微生物群多样性增加。根据Chao1指数，与对照组相比，DSS组肠道微生物群多样性增加，Arec组肠道微生物群多样性降低(表1)。基于OTU的加权UniFrac距离PCoA分析显示，三组小鼠肠道菌群组成存在显著差异(P<0.001)(图3A)。ANOSIM显示出相同的结果，对照组、DSS组和Arec组之间存在显著差异(图3B-D)。在门水平上，与DSS组相比，Arec组中拟杆菌门(Bacteroidota)和厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度增加，而变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度降低。与对照组相比，DSS组中变形菌门和拟杆菌门的相对丰度增加，而厚壁菌门的相对丰度显著降低(图3E)。在属水平上，与DSS组相比，Arec组中拟杆菌属(Bacteroides)和Odoribacter的相对丰度增加，而Parasutterella、Allobaculum、Ligilactobacillus、乳杆菌属(Lactobacillus)和Limosilactobacillus的相对丰度显著降低(图3F)。
表1. 通过Shannon、Simpson、Chao1和ACE指数评估α多样性。
图3. 槟榔碱和DSS干预会影响肠道菌群的变化。(A)基于OTU的加权UniFrac距离PCoA分析显示了各组之间的微生物差异。(B-D)基于OTU的ANOSIM组间差异分析。(E)三组小鼠门水平的肠道微生物组成。(F)三组小鼠属水平的肠道微生物组成。P＜0.05具有统计学意义。
LEfSe分析结果显示，三组小鼠肠道微生物群的主要组成是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。分类单元丰度的LDA评分表明，Arec组拟杆菌属(Bacteroides)的LDA评分高于DSS组和对照组。相比之下，对照组以乳杆菌属(Lactobacillus)为主(图4B)。如图4C-F所示，与其他两组相比，Arec组拟杆菌属和Bacteroides acidifaciens的种群数量显著增加，而Ligilactobacillus和Lactobacillus种群几乎消失。因此，拟杆菌属丰度的升高和乳杆菌属丰度的降低可能是槟榔碱处理导致更严重结肠炎症的原因。
图4. Arec组、DSS组和对照组肠道菌群的LEfSe分析结果。(A)三组小鼠肠道微生物的主要组成分类群的分类分支图。(B)直方图中LDA值的分布显示LDA评分大于4的物种。(C-F)三组小鼠代表性肠道微生物差异图。
4 槟榔碱对肠道菌群代谢的影响
肠道微生物群的代谢物调节着所有身体机能。本研究通过对小鼠血清进行非靶向代谢组学分析，分析了三组小鼠血清的差异代谢物。在正离子模式下，OPLS-DA显示三组代谢物明显分离(图5A)。此外，DSS组和对照组之间(图5B)以及Arec组和DSS组之间(图5C)的代谢物明显分离。如图5D所示，在正离子模式下，Arec组与DSS组之间不同代谢产物的聚类分析显示，两组间存在114种差异代谢物，其中25种上调，89种下调。如图5E所示，根据Arec组和DSS组代谢物结果的差异，通过KEGG通路富集分析获得了前20条代谢通路，包括烟酸和烟酰胺代谢、代谢途径、乙醛酸和二羧酸代谢等。
本研究对肠道微生物群和差异代谢物进行了联合分析。喷司他丁、硝苯地平、LPC(20:1/0:0)、麦角硫因和其他代谢物随着变形菌门和厚壁菌门丰度的增加而增加，随着拟杆菌门和放线菌门丰度的增加而减少(图6)。
图5. 槟榔碱调节血清代谢(正离子模式下)。(A-C)基于OPLS-DA的分析显示Arec组、DSS组和对照组之间的差异；DSS组和对照组之间的差异，以及Arec组和DSS组之间的差异。(D)热图反映了Arec组和DSS组之间的差异代谢物(红色为高水平，绿色为低水平)。(E) Arec组和DSS组差异代谢物的KEGG富集图。
图6. 热图显示Arec和DSS组中与差异代谢物相关的肠道微生物(红色表示高水平，绿色表示低水平)。*P<0.05和**P<0.01。
讨论
溃疡性结肠炎是一种由免疫机制和环境因素失衡引起的慢性特发性炎症性疾病，临床上多表现为腹泻、出血、吸收不良等，严重威胁人的生理和心理健康。3% DSS诱导7天后，DSS组小鼠的临床症状和病理变化表明本研究的UC模型构建成功。本研究的实验发现，5 mg/kg槟榔碱加重了DSS引起的结肠炎症状，与DSS和对照组相比，Arec组DAI评分更高，体重下降更严重，结肠缩短更明显。对小鼠肠道的病理检查显示，DSS组的隐窝、粘膜破裂和炎症细胞浸润减少；此外，槟榔碱的加入使肠道屏障的破坏和炎症细胞的浸润更为严重。
本研究还通过ELISA检测到Arec组的促炎因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)显著增加。其中，IL-6的促炎作用源于其防止T细胞凋亡的能力，但也会影响上皮屏障的促消融和修复功能。TNF-α促进T细胞增殖和分化，并加重肠道炎症。研究表明，IL-1β的升高与急性炎症的严重程度相关，抑制IL-1β的表达可减轻结肠炎症状。这些实验结果表明，槟榔碱可促进炎性因子的表达，加重UC；因此，作者对其作用机制进行了更深入的研究。
随着UC的研究越来越深入，大量研究表明肠道微生物在UC的发展中起着核心作用。因此，本研究收集了小鼠的粪便样本进行16S rRNA测序，以检测其肠道菌群组成。测序结果显示，三组的肠道微生物组成存在显著差异。在门水平上，与对照组相比，DSS处理后变形菌门的相对丰度显著增加，这与之前的研究一致。有研究显示，UC患者肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比率(F/B)降低，这与本研究的实验结果一致，并且添加槟榔碱后F/B的降低更为显著，这加剧了DSS引起的肠道菌群失调。
在属水平上，槟榔碱加剧了DSS对肠道有益细菌属的影响。乳杆菌(Lactobacillus)是肠道中众所周知的有益菌属，对结肠炎患者的肠道有保护作用。与对照组相比，DSS组乳杆菌的丰度显著降低，并且在使用槟榔碱后几乎消失。此外，DSS抑制了具有抗菌、免疫和肠道屏障增强能力的Limosilactobacillus和Ligilactobacillus的丰度。Limosilactobacillus已被证明可以影响NF-κB信号通路，从而抑制炎症，防止结肠炎的发生和进展。此外，Limosilactobacillus还能增加PD-1+滤泡辅助性T细胞依赖性IgA的诱导和产生，从而改变肠道微生物组，防止DSS诱导的结肠炎和肠道生态失调。这些结果表明，槟榔碱通过降低小鼠肠道中有益菌属的丰度进一步加剧DSS诱导的结肠炎，从而加剧结肠炎的发展。
此外，在本研究的实验中，DSS处理的小鼠肠道中拟杆菌属(Bacteroides)的相对丰度显著增加，这与先前关于共生拟杆菌在诱导小鼠结肠炎症中的潜在作用的研究结果一致。也有报道称，拟杆菌中的产肠毒素脆弱拟杆菌(ETBF)通过分泌肠毒素增加肠上皮细胞的通透性并破坏上皮屏障功能，而ETBF的定植会导致肠道急性或慢性炎症。因此，根据当前的实验结果，可以推断拟杆菌相对丰度的增加可能导致UC的发展。在本研究中，Odoribacter的丰度在使用DSS后显著增加，这与之前报道的健康个体中Odoribacter的丰度高于结肠炎患者的研究相反。然而，也有许多研究表明，Odoribacter可能是一种条件致病菌，其相对丰度的增加可能与UC的发生呈正相关。这些结果表明，槟榔碱增加了条件性致病菌的相对丰度，从而加剧了DSS诱导的结肠炎。本研究通过LEfSe分析了三组小鼠肠道微生物群的主要成分，其中益生菌乳杆菌(Lactobacillus)在对照组中得分更高，条件致病菌拟杆菌(Bacteroides)在Arec组中得分较高。这些结果进一步证实了作者的推断。
肠道微生物群可以调节免疫，维持肠道环境，并通过其代谢产物为机体提供能量。例如，色氨酸及其代谢物可以通过减少IL-22和IL-17等促炎因子来缓解肠道炎症。SCFAs的产生对肠道完整性至关重要，因为它们调节肠道pH值并影响肠道粘液的产生，从而提高粘膜免疫功能。在本研究中，与DSS组相比，槟榔碱处理后麦角硫因、喷司他丁、LPC(20:1/0:0)、Glu-glu和四磷酸二腺苷等代谢物减少。麦角硫因是一种常见的氧化剂，具有很强的抗氧化活性。研究表明，口服麦角硫因可以增加体内抗炎因子水平，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，从而保护UC免受结肠缩短和肠道病理损伤。麦角硫因被认为是益生菌Limosilactobacillus的代谢产物，麦角硫因的升高与Limosilactobacillus丰度呈正相关。这也与本研究的肠道微生物和代谢物综合分析结果一致，其中Arec组中Limosilactobacillus的相对种群几乎消失，槟榔碱可能通过降低Limosilactobacillus的丰度来减少小鼠体内麦角硫因的含量。喷司他丁是一种嘌呤抗代谢药物，常用于恶性肿瘤的治疗，它能抑制腺苷脱氨酶。研究表明，喷司他丁可以影响促炎因子的释放，并减轻IL-10-/结肠炎的影响。本研究的微生物和代谢物综合分析显示，变形菌门和厚壁菌门的喷司他丁水平升高，拟杆菌门的喷司他丁水平降低。因此，喷司他丁的减少可能表明槟榔碱处理增加了拟杆菌门的丰度，降低了变形菌门的丰度。四磷酸二腺苷是一种在缺氧和损伤等应激条件下产生的代谢物，广泛存在于原核生物和真核生物中，具有调节免疫反应、基因表达修复以及DNA复制和合成的作用。当DSS诱导小鼠应激时，分泌四磷酸二腺苷。然而，槟榔碱的使用降低了血清中四磷酸二腺苷的水平，根据我们的微生物和代谢物联合分析报告，槟榔碱可能降低了Allobaculum和乳杆菌属的丰度，增加了拟杆菌属的丰度，导致小鼠体内四磷酸二腺苷减少。基于差异代谢物结果进行的代谢途径富集分析表明，槟榔碱可能通过调节肠道菌群来调节烟酸和烟酰胺代谢、代谢途径以及乙醛酸和二羧酸代谢，从而加重小鼠UC。综上所述，本研究认为槟榔碱通过直接影响肠道微生物群的丰度来调节血清代谢物的产生。
结论
本研究表明，槟榔碱可加重DSS诱导的UC的结肠损伤，并增加炎症因子的释放。根据本研究的肠道微生物测序结果，可以得出结论，槟榔碱处理加重小鼠UC可能是通过调节肠道微生物群介导的，导致有益肠道菌群的丰度降低，条件致病菌的丰度增加。此外，微生物和代谢物联合分析表明，肠道微生物与差异血清代谢物显著相关，槟榔碱通过影响调节血清代谢物浓度的肠道菌群丰度，加剧了小鼠的UC。然而，槟榔碱作用的确切机制有待于靶向代谢组学的进一步证实。此外，还需要进一步研究槟榔碱对炎症性肠病患者的影响。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1197922/full
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