导读
中药黄芪（AR）先前已被证明对脑梗死（CI）具有神经保护作用，但深层机制尚不清楚。为了探讨AR在CI中的生物学基础和治疗机制，本研究建立了一项双盲随机对照试验，并对患者血清样本进行了蛋白质组学分析。将患者分为AR组（n = 35）和对照组（n = 30）。我们采用中医证候评分和临床指标评价疗效，并用蛋白质组学方法对两组患者血清进行分析。基于生物信息学分析方法，本研究探讨了两组样品差异蛋白的变化，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对关键蛋白进行了验证。本研究结果显示，肺活量不足（DVE）、血瘀证（BS）和NIH卒中量表（NIHSS）评分显著下降（p<0.05），而Barthel指数（BI）的得分增加，表明AR能显著改善CI患者的症状。此外，我们发现与对照组相比，AR上调了43个蛋白质，下调了20个蛋白质，尤其侧重于抗动脉粥样硬化和神经保护作用。ELISA结果显示，AR组血清IL-6、TNF-α、VCAM-1、MCP-1和ICAM-1水平显著降低（p < 0.05，p < 0.01）。本研究发现，AR能显著恢复CI的临床症状。血清蛋白质组学研究结果表明，AR可能作用于IL-6、TNF-α、VCAM-1、MCP-1和ICAM-1，并发挥抗动脉粥样硬化和神经保护作用。
论文ID
原名：Neuroprotective effect of Astragali Radix on cerebral infarction based on proteomics
译名：基于蛋白质组学分析探究黄芪对脑梗死的神经保护作用
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.6
发表时间：2023.06
通讯作者：刘建勋&任钧国&潘映红
通讯作者单位：中国中医科学院，中国农业科学院作物科学研究所
实验设计
实验结果
1. 受试者特性
本研究共招募了65名患者，其中56人完成了为期12周的治疗。试验期间，共有9名受试者退出，退出率为13.8%。受试者的基线特征总结在表1中。在这项研究中，两组患者的年龄和性别是匹配的，男性患者比女性患者多。招募时的临床指标和病史没有显著差异。超过36.67%的患者患有高血压，少数患者有冠心病和脑血管病史。血液检测常用指标两组间无显著性差异（p > 0.05）。
图1 本研究流程图
2. 黄芪治疗的结果
治疗12周后，AR组和对照组（Con）的肺活量不足（DVE）、血瘀（BS）、NIHSS和mRS评分显著降低（p < 0.05；图2），内火评分降低，而BI评分升高（p < 0.05）。此外，研究发现，与Con相比，AR组的BS显著降低，BI急剧增加（p < 0.05）。结果表明，AR能有效缓解CI患者的症状，并在一定程度上保护白质，主要改善患者的神经功能。
表1 研究参与者的基线特征
如表2所示，两组治疗前后甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL-C）无显著差异（p > 0.05）；与治疗前相同组相比，AR治疗显著降低了低密度脂蛋白（LDL-C）（p < 0.01）。
图2 AR组和对照组的症状评分指标
AR：n = 30；对照组：n = 26。Before：表示患者在治疗前的水平；after：表示患者在接受AR治疗12周后的水平。数据以平均值±标准差表示。* p < 0.05。
3. 安全评估
在本研究中测试了实验室指标，AR组和对照组之间没有显著差异（p > 0.05；见补充材料S3）。此外，两组患者在治疗期间均未出现明显不良反应。详见补充材料S3。
表2 AR组与对照组血脂水平变化的比较
TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇。* p < 0.05和** p < 0.01。
图3 蛋白质组数据的统计分析
（A）蛋白质组数据在不同样本上的序列覆盖率分布。（B）不同样品蛋白质组数据的信号强度分布。（C）Pearson相关分析（两组之间的比较采用独立样本t检验，每组n = 6，* p < 0.05）。
4. 蛋白质组学结果
4.1 定量蛋白质组学的数据质量控制
如图3所示，同一样品的标准偏差很小，表明同一样品上的数据具有良好的重复性。AR组和Con的分析发现，覆盖率在30%-40%和60%-70%之间存在显著差异。从信号强度分布图可以看出，AR组和Con在两组的不同信号强度上存在显著差异（如< 1×10 8和< 1×10 10）。Pearson相关结果说明了AR组和Con组之间的差异。有趣的是，我们在每组的六个样本中也发现了特定的差异，这可能是雄性和雌性之间的差异造成的。液相质谱（LC-MS）数据的详细信息可以在补充材料S4中找到。
图4 AR组和对照组的差异表达蛋白
（A）AR/Con差异表达蛋白的火山图。（B）AR组和对照组血清样本的热图分析（每组n = 6）。
4.2 差异表达蛋白的鉴定
蛋白质表达水平的差异是显著差异的1.2倍以上，并分析了三组之间差异表达的蛋白质（图4）。在火山图中，绿色圆点代表下调的蛋白质，红色圆点代表上调的蛋白质，蓝色圆点代表没有显著差异的蛋白质。横轴用log2（倍数变化）表示，具有显著差异的蛋白质分布在两端。纵坐标用log10（p值）表示。数值越大，差异就越明显。与对照组相比，AR上调了43个蛋白质，下调了20个蛋白质。图5中的热图显示了血清样品中所有不同蛋白质的分布，不同程度的颜色代表了蛋白质含量。可以看出，蛋白质在两组中显示出明显的聚集性。热图的结果与火山图的结果相似。与Con相比，AR组中更多的差异蛋白被上调。
图5 功能富集分析
（A）AR/Con中差异蛋白的基因本体（GO）分析。（B）AR/Con中差异蛋白的京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。
4.3 差异表达蛋白的功能分类
为了了解差异蛋白的功能类别，我们使用基因本体论和STRING数据库进行基因本体论（GO）分析。结果用富集圆图表示（图5）。从外到内的第一个圆圈是富集分类。不同的颜色代表不同的分类，包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）。蛋白质数量的刻度在圆圈之外。第二个圆圈是背景蛋白的数量和p值。蛋白质的数量越多，条就越长。颜色越红，p值就越小。第三个圆圈是每个分类中蛋白质的总数。第四个圆圈代表每个分类的丰富因素。
AR在CI患者体内发挥作用后，可能在分子功能中，包括免疫系统和能量代谢相关功能，如免疫球蛋白受体结合（GO:00044987）、Toll样受体四结合（GO:0035662）、补体组分C1q结合（GO:0.0001849）和钙依赖性蛋白结合（GO:0048306），通过生物过程，如补体激活、经典途径（GO:0006958）、先天免疫反应（GO:00045087）、肿瘤坏死因子产生的正调控（GO:00032760）和中性粒细胞聚集（GO:00070488）发挥作用。所有差异表达的蛋白质均位于细胞外空间（GO:0005615）、细胞外区域（GO:00005576）和血液微粒（GO:00072562）。
图6 PPI分析和差异表达蛋白质的ROC曲线
（A）AR/Con中差异蛋白的PPI分析。（B）六种潜在蛋白质的ROC曲线。
4.4 差异表达蛋白的聚类分析
在上述本体论分析的基础上，我们利用KEGG对差异蛋白的生物学功能进行了分析。富集因子表示富集的差异蛋白与通路中所有蛋白数量的比率。富集因子越高，富集程度越高。根据富集因子的值，我们选择前10条富集通路进行可视化。结果表明，CI患者AR治疗后调节的蛋白质主要与TNF-α信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、神经活性配体-受体相互作用和p53信号通路等生物学过程有关。研究表明，AR可能通过抗炎和抗氧化特性，促进神经发生和血管生成，在CI中发挥神经保护作用。
4.5 差异表达蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用分析
体内的蛋白质通常相互作用，完成一系列的生物过程。此外，STRING数据库(http: //string-db.org)用于预测通路中富集蛋白的相互作用，以确定CI患者采用AR治疗发展中的关键节点。为了提高PPI分析的可靠性，置信度得分设置为高置信度（≥ 0.700）。图6A展示了它们的相互作用。总共检测到32种蛋白质，并显示出AR和对照之间与其他蛋白质的复杂相互作用。在图6A中，两个蛋白质簇被证明与CI高度相关，并且红色簇包含更多的蛋白质；相互作用是复杂的，并形成了代表AR可能作用的靶蛋白的网络。与前10个KEGG途径中的蛋白质结合，IL-6、TNF-α、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1是PPI网络的中心蛋白，表明它们与其他蛋白质有多种相互作用，可能是AR的潜在靶点。
4.6 ROC曲线的原点预测
为了验证潜在靶蛋白筛选的准确性和特异性，我们建立了ROC曲线来判断预测的可行性。如图6B所示，IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的曲线下面积（AUC）大于0.7，MMP-9的AUC小于0.7，提示IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1对AR的诊断具有良好的准确性，筛选出的5种蛋白具有诊断能力。
4.7 五种候选蛋白质的验证
上述分析结果表明，IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1可能是AR治疗CI的潜在候选蛋白。ELISA定量了血清中这些蛋白质的水平，结果如图7所示。与对照组相比，AR组血清IL-6、TNF-α、VCAM-1、MCP-1和ICAM-1水平显著降低（p<0.05，p<0.01）。IL-6、TNF-α、VCAM-1、MCP-1和ICAM-1可能是AR治疗CI的潜在靶蛋白。
图7 通过ELISA测定AR组和对照组的蛋白质含量（每组n=13）
数据以平均值±标准差表示。* p < 0.05，** p ＜ 0.01。
讨论
在本研究中，我们通过随机对照试验首次评估了AR治疗CI的有效性和安全性。综合结果显示，AR显著改善了CI患者的临床症状和心功能，改善了能量代谢，调节了凝血和神经功能。结果还显示，随着AR的治疗，DVE、BS、NIHSS、mRS和LDL-C评分显著降低（p<0.05），而BI评分升高（p<0.05）。我们推断AR的治疗机制可能与调节血糖和血脂水平、改善神经功能和抗凝血活性以及降低血栓形成风险有关。
此外，定量蛋白质组学被用于进一步阐明AR的机制。比较分析显示，两组之间蛋白质的数量发生了显著变化，丰度不同，导致AR组中有63种蛋白质差异表达。此外，生物信息学分析和验证表明，AR通过作用于脂质和动脉粥样硬化、TNF-α信号通路、NF-κB信号通路和神经活性配体-受体相互作用而发挥作用。结合前10个KEGG途径中的蛋白质，对蛋白质-蛋白质相互作用功能网络的研究结果进行了进一步的全面讨论，我们发现IL-6、TNF-α、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1位于AR方剂治疗网络的中心，作为与其他蛋白质相互作用的枢纽。蛋白质主要参与免疫系统的生物学过程，包括TNF-α信号通路和NF-κB信号通路。ROC曲线和ELISA表明IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1对AR的诊断具有良好的准确性。
动脉粥样硬化病变的形成是一个复杂的过程，通常会持续几十年。动脉粥样硬化病变的形成有几个不同的因素。动脉粥样硬化是中风的前身，属于慢性血管炎症反应。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是主要的促炎细胞因子，有助于血管炎症的发生和维持。TNF-α诱导活性氧（ROS）的产生，从而驱动构成“ROS信号传导”的氧化还原反应。然而，这些ROS也可能导致氧化应激，导致血管功能障碍。动脉粥样硬化可能与细胞内IL-6水平的升高有关。在衰老过程中，骨髓脂肪细胞中的IL-6信号增加，这可能导致造血干细胞向骨髓细胞分化，并增加编码转录调节因子（如TET2）的基因突变的风险，这可能会导致造血细胞克隆的阳性选择和扩增。TET2突变的骨髓细胞克隆结果显示IL-6和IL-1β可能导致动脉粥样硬化加速。NF-κB信号通路的激活可能与缺血性心脑血管疾病的加重有关。先前的研究也表明，包括AR在内的中药处方可以抑制NF-κB信号通路并调节血脂水平以治疗动脉粥样硬化。
TNF-α信号通路和NF-κB信号通路与炎症和神经元凋亡密切相关，它们是参与调节生物体细胞分化和凋亡以及控制炎症和免疫反应的重要核转录因子。炎症信号传导由血液来源的白细胞激活和完成，白细胞在缺血期间透过大脑，产生炎症细胞因子和促炎介质，包括TNF-α、IL-6和ICAM-1。TNF-α是一种常见的细胞因子，可促进炎症，诱导炎性细胞因子的释放，并促进细胞坏死。与对照组相比，AR组治疗后TNF-α水平显著下降（p<0.05），提示AR的神经保护作用可能与抑制脑缺血引起的神经源性炎症有关。至于ICAM-1，其他研究通过参与炎症和细胞凋亡过程，确定了该蛋白在动脉粥样硬化发展中的关键作用。ICAM-1存在于动脉粥样硬化病变中，并参与其进展。除了在白细胞迁移中发挥众所周知的作用外，ICAM-1现在已被证明能够传递细胞内信号，导致肌动蛋白重排到骨骼并激活促炎级联反应，从而使炎症反应持续。此外，AR可以减少ICAM-1和VCAM-1的表达，从而减少人内皮细胞中NF-κB的激活。多年来，MCP-1已成为一种重要的趋化因子，在许多中枢神经系统疾病中发挥着关键作用。MCP-1已被推荐为缺血性卒中的早期预测因子。AR显著下调MCP-1，这可能通过减少神经损伤、炎症反应和缺血性梗死面积而发挥作用。上述结果表明，AR可能通过减少促炎物质在CI中发挥神经保护作用，从而抑制TNF-α信号通路和NF-κB信号通路的激活。
我们的研究仍然存在一些局限性和不足。首先，我们只检测了患者治疗后的血清蛋白；因此，我们需要在整个过程中进一步检测血清蛋白质组学等时间点的变化。此外，可能需要更多的患者和更多的实验来证明上述结论。
结论
总之，本研究发现AR可以显著改善CI的临床症状。此外，基于临床CI患者血清蛋白质组学研究结果，我们发现与对照组相比，AR上调了43个蛋白质，下调了20个蛋白质。通过蛋白质功能富集分析，发现AR可能作用于IL-6、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1，并发挥抗动脉粥样硬化和神经保护作用。本研究从蛋白质水平探讨AR方治疗CI的生物学机制，为临床治疗CI及中医药相关研究提供分子基础。
原文链接：
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2023.1162134/full
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