程序性细胞死亡 (Programmed cell death，PCD)，被称为细胞凋亡，在多细胞生物的发展进程和维持体内平衡中起着至关重要的作用。
以秀丽隐杆线虫 (C.elegans) 为例，程序性细胞死亡的启动以唯一的半胱天冬酶、CED-3 (cell death abnormal, CED) 的激活为标志，这一过程需要 CED-4 凋亡体的组装。
活化的 CED-3 与 CED-4 凋亡小体形成全酶，切割多种底物，进而导致不可逆的细胞死亡。然而，尽管经过科学们孜孜不倦的数十年研究，CED-4 促进 CED-3 激活的潜在机制仍然难以捉摸。
2023 年 7 月 4 日，西湖大学施一公团队在 Life Science Alliance杂志发表研究论文 Structural insights into CED-3 activation，该研究组装不同的 CED-4/CED-3 冷冻电镜复合物结构来模拟 CED-3 的顺序激活阶段，解析了保守的 CARD-CARD 相互作用促进了 CED-3 的激活，而 CED-4 凋亡的动态组织的调节启动了细胞程序性死亡的开始，揭开了 CED-4 促进 CED-3 激活的潜在机制的神秘面纱。
研究背景
通常，细胞凋亡的执行以被称为「caspase——半胱天冬酶」的细胞杀伤蛋白酶的激活为特征，它包括启动半胱天冬酶和效应半胱天冬酶。启动半胱天冬酶被细胞凋亡等蛋白质机制激活，而效应半胱天冬酶可以被启动半胱天冬酶直接切割和激活。
最早在秀丽隐杆线虫中发现功能保守的细胞凋亡通路，其中 CED-3（cell death abnormal, CED）是唯一的半胱天冬酶，CED-3 作为无活性酶原合成，它的激活需要与 CED-4 细胞凋亡相关。
在非凋亡条件下，二聚体 CED-4 被 Bcl-2 家族成员 CED-9 隔离。而八聚体 CED-4 凋亡小体的晶体结构呈不对称二聚体的四聚体，呈漏斗状结构，其中 8 个半胱天冬酶募集结构域（CARDs）在窄端形成两层四聚体环，核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）包围一个更大的环。
然而，CED-3 和 CED-4 之间保守的 CARD-CARD 相互作用的作用尚不清楚。
研究内容与结果
为了进一步了解 CED-4 对 CED-3 的激活机制，本研究组装了不同的 CED-4/CED-3 复合物用以模拟 CED-3 的顺序激活阶段，并确定其冷冻电镜结构。
在 CED-4 凋亡细胞的晶体结构中，上面的 CARDs 与下面的 CARDs 形成一个相同的环，上环相对于下环旋转 45 度，使每个 CARDs 互相接触。在重构的六聚体中，上层 CARDs 位于下层 CARDs 的外围，每个上下 CARDs 之间只有一个接口。
进一步对结构细节进行探索，CED-3 的 H1 和 H4 螺旋参与了 CED-3 和 CED-4 之间的 CARD-CARD 相互作用。CED-3 上的碱性残基，包括 Arg7、Arg63 和 Arg64，似乎与 CED-4 CARD 上的酸性残基，包括 Asp20、Asn78 和 Asn79 相接触、互相作用。
之后，本团队研究了 CED-4 细胞凋亡对 CED-3 蛋白酶活性的影响。用体外翻译的 CED-3 R7D 作为底物检测 CED-3 的酶活性，而 CED-3 R7D 不能被 CED-4 凋亡细胞激活。实验结果显示只有 CED-3 R7D 底物被生物素化标记，因此能够被可视化，而 WT CED-3 和催化突变体（C358A）则未标记。也就是说，CED-4 激活了 CED-3，有效地切割了底物，表明 CED-3 酶原是活性 CED-3 的底物，与 CED-4 凋亡小体结合可提高 CED-3 的蛋白酶活性。
至此研究，CED-4 和 CED-3 之间的 CARD-CARD 相互作用在全酶的结构中得到了彻底的表征。令人出乎意料的是，研究人员观察到 CED-4 凋亡小体和 CED-4/CED-3 复合物的多种低聚状态，这为 CED-4 促进 CED-3 活化的机制提供了前所未有的见解。
研究展望
总之，本研究报告了系统的结构和基于结构的生化分析，揭示了 CED-3 的激活机制。通过低温电镜成像，捕捉到 CED-4 细胞凋亡的不同寡聚状态，无论是单独的还是在细胞中与 CED-3 的复合物。其中 CED-4 细胞凋亡体，单独或在 CED-3 催化结构域存在时，呈现三种状态，包括六聚体、七聚体和八聚体。
正如本文讨论所言，尽管冷冻电镜成像技术取得了进步，但目前无法提高 CED-4 凋亡细胞中 CED-3 催化结构域的密度，这限制了人们对 CED-4 相关的 CED-3 功能的理解。此外，双突变 R63A/R64A 导致 CED-3 自裂活性升高的原因尚不清楚。CED-3 的 CARD 本身是否在 CED-3 的激活中起抑制作用还有待研究。
转自：“丁香学术”微信公众号
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