Nat. Method | 光调控的LOV-Turbo实现活细胞中邻近标记的精准时空调控

蛋白质相互作用网络和蛋白质区域化是细胞内所有信号和调控过程的基础。邻近标记作为近些年发展起来的一项检测活细胞内蛋白互作关系和亚细胞结构蛋白组的新型技术, 已成功应用于多种动植物体系的研究。酶催化邻近标记已成为研究活细胞中蛋白质空间和相互作用特征的新方法。

TurboID邻近标记技术通过给诱饵蛋白融合一个具有特定催化连接活性的TurboID酶。TurboID是由大肠杆菌的生物素连接酶（BirA）定向进化而来的，能够将生物素和ATP生成生物素-AMP混合酸酐，该酸酐从其活性位点释放出来，共价标记附近蛋白的亲核赖氨酸侧链。在Turbo ID的催化作用下将生物素共价连接到酶邻近的内源蛋白, 通过富集和分析被标记的蛋白可获得与诱饵互作的蛋白组。

近日，斯坦福大学的Alice Y. Ting团队，在《Nature Methods》杂志发表了题为“HEngineered allostery in light-regulated LOV-Turbo enables precise spatiotemporal control of proximity labeling in living cells” 的文章。解决了TurboID目前的限制，生物素内源性干扰，时间特异性和空间特异性。报告了TurboID的光调节变体“LOV-Turbo”，实现了TurboID无法实现的新应用，包括脉冲追逐标记以绘制生命系统中蛋白质组动力学。

光是一种多功能输入，可以在空间和时间上精确地传递，甚至可以在体内传递。TurboID结合光调节将能够精确控制蛋白质组标记的时间窗口及标记位置。实现在黑暗状态下标记背景低，受光调控的TurboID是快速可逆的，并且在所需的标记期后关闭活性。作者将LOV感光基序整合到TurboID中，以调节其光活性。LOV的核心形成紧密的配合物或“钳位”，其C端Jα螺旋处于黑暗状态，但在蓝色470nm光的存在下释放Jα螺旋。依据BirA的晶体结构，在TurboID中选择了九种不同的表面暴露环，31插入位点，有的完全没活性，有的活性受损，有的没有光依赖性，只有80/81符合要求。作者进一步优化了80/81 LOV-Turbo，以提高±光信号比。作者发现在LOV N端去除4种氨基酸可降低暗态活性，同时保持光态活性，使±光信号比提高2倍以上。（图1）但其表达水平远低于TurboID，作者转向酵母展示作为LOV-Turbo的定向进化平台，改善LOV-Turbo1的表达。

LOV-Turbo可以被470 nm的蓝光激活，但不能被660 nm的红光激活，这有助于在红光照明的暗室中处理LOV-Turbo样品。1 mW/cm 的15min连续照明下具有最佳开启效果。10-1000 ms，2.5 mW/cm2，33%的光可以激活。作者探究了LOV-Turbo在HEK 293T细胞中多个亚细胞区室的功能。在细胞质、细胞核、线粒体基质、线粒体外膜和面向细胞质的内质网膜中观察到强烈的光和生物素依赖性标记。每个隔室通过链霉亲和素印迹给出一个独特的“指纹”，反映了LOV-Turbo在每个位置标记的不同亚细胞蛋白质组。在细胞质中，LOV-Turbo比TurboID更活跃，而TurboID在细胞核和线粒体基质中的活性更高。（图2）

LOV-Turbo是可逆的，并且开启和关闭都很快，发生在施加光和移除光的几秒钟内。光激活的LOV-Turbo在去除光照时逆转到非活动状态，1min加入biotin标记强度低于0min，说明1min就开启。LOV-Turbo可以用于细菌，酵母和神经元以及老鼠大脑的光依赖性邻近标记。在神经元的标记过程中，由于培养基中生物素含量高，使得无法控制TurboID标记时间窗口。（图3）

LOV-Turbo减少背景并提高空间精度，如果没有光，即使在0.5mM生物素存在的情况下，LOV-Turbo的标记也可以忽略不计。其次，LOV-Turbo提高了邻近标记的时间特异性。TurboID可以使用培养基或体内存在的低水平生物素在添加外源性生物素之前启动标记。LOV-Turbo支持的第三个应用是脉冲追逐标记，使用LOV-Turbo的脉冲追逐标记结合热击，可以追踪重新分配到细胞核的生物素化蛋白质。LOV-Turbo的第四个应用，即基于LOV的光遗传学工具可以通过荧光素酶通过生物发光共振能量转移（BRET）的生物发光来控制。（图4）

作者通过进行两种基于定量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学实验，进一步探索了LOV-Turbo在活细胞中脉冲追踪标记的应用。使用LOV-Turbo标记来自胞质面的内源性内质网膜相关蛋白质组。处理之后，内质网到细胞核样本中，我们检测到ATF6，一种已知的应激反应内质网定位的转录因子且验证了ATF6在试剂诱导的内质网应激后被裂解。用FCCP处理细胞，跟踪线粒体蛋白，发现药物使线粒体去极化并防止蛋白质输入，减少了线粒体蛋白质数量。（图5）

本文开发了邻近标记酶TurboID的可逆蓝光门控变体-LOV-Turbo。LOV-Turbo大小为50 kDa，比TurboID（16 kDa）大34 kDa，并拥有极宽的动态范围：即使在存在 0.5 mM 生物素（通常用于标记50-100 μM生物素）的情况下，在黑暗状态下也几乎检测不到活性，并且光态活性与TurboID相当。在这项研究中，LOV-Turbo的折叠开启范围为50至170倍，具体取决于标记时间和细胞器。光诱导开启速度很快，只需移除光源即可快速逆转。我们展示了LOV-Turbo在多个哺乳动物亚区室，酵母和细菌以及小鼠大脑中起作用。

原文连接：

https://www.nature.com/articles/s41592-023-01880-5#Bib1

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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