Nature子刊│杨辉团队开发尺寸更小的Cas12f1蛋白，为临床治疗奠定新基础

V-F CRISPR-Cas12f系统由于Cas12f蛋白的紧凑尺寸而成为治疗应用的有力候选者。

2023年4月11日，辉大基因/中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心/中国科学院神经科学研究所杨辉团队在Nature Communications 发表题为“Engineered CRISPR-OsCas12f1 and RhCas12f1 with robust activities and expanded target range for genome editing”的研究论文，该研究从组装的细菌基因组中鉴定了哺乳动物细胞中6个具有核酸酶活性的未表征的Cas12f1蛋白，其中来自Oscillibacter sp. 的OsCas12f1 (433 aa)和来自Ruminiclostridium herbifermentans 的RhCas12f1 (415 aa)分别靶向富含5'T的PAMs和富含5'C的PAMs，显示出最高的编辑活性。

通过蛋白质和sgRNA工程，该研究构建了增强的OsCas12f1（enOsCas12f1）和enRhCas12f1变体，分别具有5'-TTN和5'-CCD（D = not C）PAMs，与工程变体Un1Cas12f1（Un1Cas12f1_ge4.1）相比，表现出更高的编辑效率和更广泛的PAM。此外，通过将不稳定结构域与enOsCas12f1融合，制备了诱导性enOsCas12f1，并通过单个腺相关病毒递送来证明其在体内的活性。最后，基于死亡形式的enOsCas12f1的表观遗传编辑和基因激活也可以在哺乳动物细胞中实现。因此，这项研究为基础研究提供了紧凑的基因编辑工具，在治疗应用中具有非凡的前景。

另外，2023年1月9日，中国科学院神经科学研究所杨辉课题组和临港实验室/上海脑科学与类脑研究中心胥春龙课题组合作在Nature Biotechnology上发表了题为“ Programmable A-to-Y base editing by fusing an adenine base editor with an N-methylpurine DNA glycosylase ”的研究论文，该研究开发了一个腺嘌呤碱基颠换编辑器（AYBE，Y = C or T），用于哺乳动物细胞中A-to-C和A-to-T转基编辑，通过融合腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，ABE)和次黄嘌呤切除蛋白N-甲基嘌呤DNA糖化酶(N-methylpurine DNA glycosylase，MPG)。研究还设计了AYBE变体，能够在基因组位点上进行靶向编辑，具有更高的转化编辑活性(A-to-C或A-to-T编辑活性高达72%)。总之，该研究首次实现了高效的腺嘌呤碱基颠换编辑，对于基础研究领域疾病模型的建立及基因治疗领域等都有着至关重要的意义（点击阅读）。

这种可利用的、RNA可编程的CRISPR-Cas系统，作为对抗噬菌体感染和外来质粒的适应性免疫系统，已被开发成一种多功能工具，用于基因组编辑和修改各种生物体中基因表达的调节。根据Cas效应器的多样性及其基因组位点的结构，CRISPR-Cas系统分为两类（1类和2类）和六种主要类型（I-VI型），具有>30个亚型。第2类系统，包括 CRISPR-Cas9，-Cas12a及其衍生的基因编辑工具，广泛应用于基础研究、基因治疗和农业生物技术开发。然而，它们的大尺寸（通常为>1000个氨基酸（aa））超过了病毒载体的包装限制，因此阻碍了它们的递送。

据报道，一种使用Cas12f效应蛋白（400-700 aa）的非常紧凑的第2类V-F CRISPR-Cas系统在真核生物中起作用。通过对sgRNA进行工程改造，发现重组Un1Cas12f1_ge4.1变体可以包装成单个重组腺相关病毒（rAAV）载体，在某些基因组位点表现出高编辑效率（即与SpCas9相当）。这一发现表明，采用V-F CRISPR-Cas型系统进行体内治疗编辑具有相当大的潜力。然而，Un1Cas12f1_ge1.4的限制性5'-TTTR PAM可能会阻碍其广泛应用。通过开发可在单个rAAV衣壳载体中包装的紧凑、宽靶点范围、高效和高保真度Cas12fs，治疗性基因组编辑的应用(尤其是需要全身递送的基因组改变)可得到显著推进。此外，体内可控基因编辑系统始终是该领域对减少脱靶效应的关注点。

V-F型系统CRISPR基因座及Cas蛋白的鉴定与表征（图源自Nature Communications ）

该研究介绍了两种来自Oscillibacter sp.（OsCas12f1）和Ruminiclostridium herbifermentans（RhCas12f1）的超致密Cas12f1。通过蛋白质工程和sgRNA优化，该研究生成了增强的OsCas12f1（enOsCas12f1）和enRhCas12f1变体，显示出更高的编辑效率和低脱靶效应，以及人类细胞中更广泛的靶位点识别。

enOsCas12f1及其诱导型通过单次AAV递送应用于人源化mdx小鼠抗dystrophin的有效恢复。此外，enOsCas12f1可以用于表观基因组编辑和基因激活。综上所述，enOsCas12f1和enRhCas12f1代表了具有广泛应用的高性能基因编辑工具，而时空控制DD-enOsCas12f1是一个有前途的基因治疗平台。

参考消息：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-37829-7

转自：“iNature”微信公众号

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