相比于表观修饰、转录、翻译过程，处于转录下游产物的蛋白质、代谢物往往具备更强的表型解释能力，这两个组学也常作为上游调控机制（如：基因的转录、翻译过程）的延伸，将基因调控与表型响应关联起来，多角度阐述表型差异的内在调控机制。
不同于具有A、T、C、G、U碱基序列信息的DNA、RNA。蛋白质、代谢物则是由元素（C、H、O、N等）构成的立体化合物，想依赖测序技术获得大量的蛋白质、代谢物种类和丰度信息，目前较难实现。主要原因在于：1.部分蛋白质无特异性抗体，会缺失无抗体的蛋白质信息；2、利用算法将序列信息转化为氨基酸时，会存在部分“翻译”错误；3、代谢物本身没有序列信息。为更全面的量化这两种物质在样本中的表达特征，色谱-质谱（GC-MS、LC-MS）联用技术则广泛使用在蛋白质组和代谢组研究中。利用色谱柱的高效“聚类分离”能力和质谱仪准确“打谱鉴定”化合物的手段，实现样本中蛋白质和代谢物的全面检索。后期结合数据库（uniprot、HMDB、mzCloud等）实现物质种类注释。
随着色谱仪-质谱仪检测仪器的不断升级，其对物质的检出和定量效果不断提升。面对多种色谱类型以及更多样的质谱仪，明确其内在的原理和参数才能在众多质谱仪中不迷失方向，选择性价比更高、更合适的仪器。
转录下游产物的鉴定流程
首先，下游产物的预分离主要在色谱中完成。
色谱“聚类分离”
由于物质种类多样，还存在同分异构的情况，当有上千种或上万种具有不同结构的蛋白质或化合物进行检测时，如果将其直接上样到质谱仪中，无疑会给质谱检测带来巨大压力，往往表现出离子间的相互抑制、谱图复杂难以解析等难题，导致检测到的物质会少。会与我们想尽可能多的检测蛋白质、代谢物的目标相背离。为了解决这一问题，目前常用的手段则是在质谱仪检测前串联一个色谱装置。
色谱（chromatography），又可称为色层法或层析法，类似于薄层层析法。从样本中提取到蛋白质或代谢物溶液后，进一步注入到色谱仪中。由于物质的理化性质、极性、非极性等特征，当其流过色谱仪中的色谱柱时，在色谱柱中的停留时间不同（图1）。根据这个“时间差”，可将复杂的物质进行初步预分离，即实现将具有相似极性特征的物质聚集，不同性质的物质分离的效果。完成这一步之后，再对不同时间点收集到的物质分别上机检测，质谱仪的检测压力就会小很多，离子间的抑制效应得到极大改善，检测到的物质种类有明显的提升。
因为分离过程主要在色谱柱中完成，色谱柱的类型、性能可直接影响“聚类分离”效果。对于挥发性气体物质的检测往往使用气相色谱柱（Gas chromatograph，GC），非挥发性物质则更多使用液相色谱柱（liquid chromatograph，LC）。这两种类型的主要差异在于色谱柱中的填料不同。
除了分离功能外，色谱仪同时配备检测系统，记录每类物质在色谱柱的保留时间（RT）、峰强度等信息，便于辅助后续的物质鉴定。
Tips
对于内源性大分子-蛋白质而言，因具备盘曲折叠结构，不利于直接检测，往往在进行色谱前会对样本进行酶解，形成小片段的肽段后再进行色谱分离；对于内源性小分子—代谢物，提取完代谢物后可直接进行色谱分离。
质谱“打谱鉴定”
色谱的主要功能是对蛋白质、代谢物的预分离，想要获得其真面目，看清它们是谁还需借助质谱仪的力量，经质谱仪“打谱”功能，获得物质的质谱图、质荷比（m/z）再结合色谱中的RT信息，与数据库中收录的m/z、RT、离子强度（Intensity）进行比对，根据比对打分值实现最终的物质定性。因此，如果说色谱是“聚类分离”，那质谱就是“打谱鉴定”过程。
为了获得更准确的m/z，离子信号强度（Intensity）等信息，其性能尤为重要。质谱仪主要由三部分组成：离子源、质量分析器、离子检测器。
离子源主要起电离的功能，可轰击由色谱分离的各组分物质，使其带上电荷，形成具备不同质荷比的带电离子，经加速电场的作用，形成离子束进入后续的质量检测分析器中检测。根据电离的方式不同，可分为电子轰击电离源（Electron Ionization，EI）、电喷雾电离源（Electrospray Ionization，ESI）、基质辅助激光解析电离源（MALDI）等。
电子轰击电离源（Electron Ionization，EI）
EI比较适用于相对分子量较小（＜600）的中性有机分子的电离，这些分子往往在不分解的情况下用于气相分子检测，气相分子进入离子源，受到灯丝发射的自由电子的轰击。电子轰击后，导致硬电离的产生，分裂分子，使分子成为带正电荷的粒子。由于更适用于气相分子的检测，常用于GC-MS实验中。
电喷雾电离源（Electrospray Ionization，ESI）
ESI过程大致可分为液滴形成、去溶剂化、气相离子的形成3个阶段。样品溶液（A）通过雾化器进入喷雾室，同时雾化气体（如N2）通过围绕喷雾针的同轴套管进入喷雾室。由于雾化气体强的剪切力及喷雾室上筛网电极与端板上的强电压（2-4Kv），将样品溶液拉出，并将其碎裂成小液滴。随着小液滴的分散，在静电引力的作用下，一种极性离子移到液滴表面，样本被载运并分散成带电荷的更微小液滴。在干燥器-氮气的逆流作用下，液滴的直径随之变小，液滴表面电荷密度增加，当达到极限时，液滴发生爆裂（Columbic repulsion）。随着液滴的不断爆炸，裸离子从液滴表面发射出来，转变为气体离子进入后续检测。
ESI的优势主要体现在可用于生物大分子检测的同时，对高分子量的分子通常会带有多个电荷，电荷状态的分布可以精确对分子量定量，并提供精确的分子质量和结构信息。而且检测时间短，提供正离子模式ESI（+），负离子模式ESI（-）检测，还可与各种色谱联用，用于复杂体系的分析。目前，蛋白质组和LC-MS/MS的非靶向、广泛靶向代谢组常用该方式进行电离。
基质辅助激光解析电离源（MALDI）
MALDI电离中，样品首先与大量过量的基质化合物（CHCA、DBA等）形成共结晶，之后通过激光照射形成基质电子。该方式同样区分正离子模式（pos）和负离子模式（neg）。目前常在空间代谢的检测中发现其身影。在《空间代谢检测参数知多少？》有做过详细介绍，这里就不过多赘述。
经过电离源离子化后，带电离子会进一步进入质量分析器进行离子特征的检测，如m/z、离子强度等信息，是后续确定物质类型的关键！也是QE HF-X、Orbitrap Fusion™ Tribrid™（Fusion）、Lumos、QE等质谱仪差异的主要因素。
各种琳琅满目的质谱仪，主要是内核搭载的质量检测器不同。质量检测器的主要功能就是对电离后的离子按照质荷比进行分离。由于分离的原理不同，目前常用的分离方式主要有：四极杆（Quadrupole，Q）、飞行时间（Time of flight，TOF）、离子阱（ion trap）、轨道阱（Orbitrap）等。
在介绍质量分析器之前，先明确几个常见评估指标；a.准确度（accuracy）：指离子测量的准确性。一般用真实值和测量值之间的误差进行评价，单位ppm（part per million）；b.分辨率（Resolution）：是指质谱仪区分两个质量相近的离子的能力。分辨率越高，准确度越高；c.灵敏度（sensitivity）：是指检测器对一定样品量的信号响应值，即最少样品量的检出程度。
这三个指标是判断质谱仪等级的关键参数，对物质检测准确度，检测种类有较高影响，可以说直接影响了最终的定性定量。
四级杆（Quadrupole，Q）
四极杆分析器（图4A）是由四根圆柱形金属棒组成，两根接正极，两根接负极。通过切换直流和交流电压控制离子在四极杆内运动，一边飞行，一边转圈。当扫描电压和频率一定的时候，只有特定m/z的离子才会显示出稳定的轨迹，进而传输到检测器中获得离子的m/z值，其他离子就会因偏转太多而打到四极杆上。通过实时改变直流和交流电压，将具有不同m/z值的离子一个接一个的传输到检测器中。四极杆分析器分辨率较低，准确度不高，但稳定性好，数据重复性高且精密度高。适合分析较为简单的样品，或者复杂样本靶向检测和定量。
飞行时间（Time of flight，TOF）
飞行时间分析器（图4B）由脉冲离子源、加速栅极、无场飞行管和检测器组成。在相同加速电压的作用下，根据被加速后的离子经过无场飞行管到达检测器，由于所有离子的初始动能是相同的，重的离子飞行速度会慢一些，轻的离子飞的快，不同m/z的离子到达检测器的时间不同，可根据时间来计算离子的质荷比。TOF具有最快的扫描速度和最宽的分子量检测范围，较四极杆而言，其灵敏度，分辨率、分子量检测范围都有所升级。同时，气相色谱和液相色谱都可与之对接，使用场景更多样。
线性离子阱（ion trap）
线性离子阱分析器（图4C）横截面比较类似于四极杆，在电流电压下可使离子一直保持在离子阱中心运动，通过调节电流电压，特定离子会被弹射出来用于后续的碎裂和质量分析。因此，离子阱同样具备特定离子的选择过滤功能。相较于四极杆而言，线性离子阱具有更大的离子容量和扫描速度，灵敏度和离子质量检测范围也得到提升。
轨道阱（Orbitrap）
轨道阱分析器（图4D）是一种静电离子阱。在轨道阱中，运动的离子被静电场捕获，在静电力的作用下，离子受到朝向中心点的静电引力作用，由于离子进入轨道阱时具备初始速度和角度会产生离心力。在静电引力和离心力双重作用下，迫使离子以螺旋模式运动。通过傅立叶变换（Fourier transform）获得不同质量离子的振荡频率，从而精确读取离子的m/z信息。相对于四极杆、TOF，其灵敏度和分辨率得到质的提升，分子检测范围也有所扩大。
每通过一个质量分析器就是一个MS过程。在实际检测过程中，尤其对于非挥发性的物质检测，常常有多个质量分析器串联使用的情景。如LC-MS/MS就是指经液相色谱分离后的物质，在两个串联质量分析器的作用下完成母离子检测和子离子检测过程。之所以称为母离子和子离子，是因为两个串联质量分析器间会添加一个碰撞室（Activation cell），进行二次碎裂（图3）。因此，二次碎裂前的称为母离子（MS1），二次碎裂后的离子称为子离子（MS2）。
Tab1不同质量检测器汇总如下
Tips
质量过滤器可过滤特定质荷比的离子，可让特定的离子穿过四极杆，可用于目标离子的筛选；质量检测器用于检测不同质荷比的离子。
质谱仪的命名多直接用其质量分析器表示，如：
蛋白质组检测常用：HF-X/Fusion是四极杆与Orbitrap组合；Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 是四极杆、线性离子阱、Orbitrap共同组合；
代谢组检测常用：QQQ质量分析器，又称为三重四极杆，本质就是三个四极杆串联而成。可用于靶向代谢组和广泛靶向代谢组的检测；非靶的Q-TOF（图4B）就是由Q和TOF串联而成。
不同仪器搭配组合可适用于不同场景，也会影响最终的检测结果。如在仪器性能上：HF-X ＞Lumos＞Fusion。（虽然HF-X和Fusion的质量检测器组成相同，但HF-X改进为大容量离子传输管，极大提高了离子传输效率并优化了扫描时间和灵敏度，其整体性能上要优于Fusion）
常用质谱仪类型—3D\4D质谱仪
近两年，在质谱仪更新换代的背景下，用于蛋白质组学检测的质谱仪可划分为两大类型：
1. 以QE HF-X、Orbitrap Fusion™ Tribrid™（Fusion）、Lumos为主的3D检测仪器，又称为3D-质谱仪；
2. 以赛默飞研发的Orbitrap Exploris 480、布鲁克研发的 tims TOF pro，tims TOF pro2为首的4D检测仪器，又称4D-蛋白质组学。
3D即指上文说到的，利用色谱-质谱获得的保留时间（Retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（Intensity）3个维度的信息，辅助完成物质的定性定量。
4D主要是在3D的基础上增加一维离子淌度（ion mobility）信息，即离子迁移率的分离。该步骤可将离子按大小、形态、结构进行分离，从而降低检测难度，同时灵敏度、扫描速度也得到提高。由于可以区分三维结构，可实现同分异构体的分离和检测。
如，Orbitrap Exploris 480就是QE HF-X的升级改造，与3D QE HF-X不同的部分是，该仪器在ESI离子源部分与Orbitrap之间连接了一个高场不对成波形离子迁移谱仪（FAIMS，high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry），该仪器可以在肽离子离开ESI离子源并进入质谱仪之前对其进行快速有效的气相分离，以增加蛋白质组分析深度，因此对复杂样品的定性和定量效率较高。同时分辨率、灵敏度检测范围都得到提升。
tims TOF pro内核则是Q-TOF串联，但又不同于3D的Q-TOF，在进入四极杆之前会先进行离子淌度的分离获取CCS值（Collisional Cross Section：根据离子在运动时与缓冲气体碰撞的碰撞截面计算得到该值），同时在灵敏度、分辨率、扫描采集速度上均有所提升。在物质鉴定时使用ccs、 RT、m/z、Intensity四个维度的信息。
相比于3D而言，4D的主要优势在于：①可区分同分异构体物质；②样本用量减少，约3D样本的2/3。4D的检测灵敏度有所提高，可适用于微量样本、珍贵临床样本或用于多组学分析的实验样本，以节省样本；③适用复杂样本的解析。如由不同组合混合得到的样本，其检测效果要优于3D质谱仪。但对于血清、血浆、动物常用组织等，3D也可满足检测要求，使用3D的成本更低。④在相同检测机时下，4D质谱仪得到的蛋白质种类多于3D。或者在检测到相似数量蛋白质时，4D花费的时间更短。
当然，由于增加了一个维度的信息，4D的检测成本也更高。对于不需要区分同分异构体的实验或简单常规样本的实验（如：血清、血浆、常见组织），3D质谱检测已然能够达到检测需求，性价比更高。
目前，基迪奥可提供3D、4D蛋白质组检测以及QQQ和Q-TOF的代谢组检测。使用的也是最主流、最新、高效的质谱仪。保障您的质谱检测需求，限时好价咨询~
参考资料https://www.creative-proteomics.com/blog/index.php/several-types-of-mass-analyzer/
转自：基迪奥生物
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