艾问艾答｜彩色VS黑白WB图？荧光&化学发光WB优劣势盘点

今天，咋咋唬唬的小师弟又来考小艾了

这就是师弟发来的图啦：

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荧光 WB，其中绿色为 beta Catenin 信号，红色为 GAPDH 内参

小艾心想，这不就是普通的荧光 WB 吗，难道小师弟只见过下面这样的 WB 结果？

化学发光 WB，黑色条带为 beta Catenin 蛋白信号

见小艾面不改色，小师弟可慌了神，难道是他大惊小怪，又找了个小艾早就知道的东西出来？还真是。

PART.01

为什么会有不同的 WB 图？

我们在 WB 实验中通过一系列操作将样品中的蛋白转移到膜上以后，接下来就要通过抗体识别靶蛋白并显影了。至于这个显影，既可以用荧光法、又可以用依赖于酶促反应的化学发光法。

师弟找到的这两张图，其实是用同一款抗体（重组 Anti-beta Catenin 抗体[E247] - ChIP Grade (☞ab32572）做为一抗，然后用不同的二抗检测得到的。下面，小艾就介绍一下这两种显色方法的区别。

PART.02

如果用荧光显色做 WB…

荧光显色就是在抗体上偶联上荧光分子，孵育抗体后通过荧光成像仪的相应通道检测样品中的特定蛋白。荧光 WB 的一个主要优点就是可以进行多重测定，只要选择的荧光激发光波长（Ex）和发射光波长（Em）不重叠，且成像仪支持相应的激光通道，就能在一张膜上同时进行多种蛋白标记。

由于多个指标可以在一张膜上同时进行标记，无需 strip 和重新标记就可以对内参进行归一化。应用 IRDye® 二抗还可以提供比基于酶的方法更宽的动态范围，使其成为量化相对蛋白质丰度的最佳选择。另外，荧光法获得的信号更加稳定，在保存良好的情况下可以持续数月至数年。

PART.03

如果用化学发光做 WB…

化学发光则一般是用偶联了辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的二抗，加入底物显色，然后通过成像系统或者胶片收集数据。通过这种方法获得的信号会随着时间的推移快速消退，稳定性较差，仅能维持数小时左右甚至更短。由于化学发光一般一次只能检测一个靶蛋白，如果要检测多个靶标，就需要 strip 后重新孵育或在不同的膜上孵育，实验操作繁琐且消耗的时间较长。

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荧光 WB 和化学发光 WB 原理图

PART.04

这两个方法分别有什么优缺点？

化学发光

红外荧光

优点

多重染色

不能

能

红外 WB 无需对膜进行 strip 和重新标记即可进行归一化或对比分析。

检测

间接

（酶促反应）

直接（荧光）

使用 IRDye® 二抗，信号与目标蛋白量直接成正比，而在化学发光中酶/底物反应可能会产生影响。

稳定性

数小时

数月至数年

IRDye® 荧光信号高度稳定，因此可以储存膜然后再次成像。

灵敏度

红外检测比其它荧光方法的灵敏度更高，与化学发光的灵敏度相当。

时间

IRDye®  二抗的动态范围宽，减少了多次曝光的需要从而节省您的时间。

二抗

☞HRP 或☞AP 偶联二抗

☞IRDye® 偶联二抗

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*化学发光和红外荧光 WB 的比较

小师弟这才发现，原来还有这么多他不知道的东西。不过这么一来，他至少学到了一些东西。希望这也能给您未来的实验提供更多参考哦~

转自：Abcam Abcam

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