巨噬细胞是机体内的一种非特异性免疫细胞，它是宿主对病原体反应、调节炎症和组织再生的重要参与者。它们能快速感知来自周围环境的多种信号，整合信号并进行相关响应。在不同环境中，巨噬细胞能够向促炎（M1）或抗炎（M2）的特定功能表型两极分化，而M1和M2状态之间的切换取决于它们的代谢重编程。
线粒体是高速移动和动态的细胞器，不断经历裂变和融合，从而影响其活性氧水平、钙稳态及氧化磷酸化。裂变有助于受损线粒体的分离以及自噬降解，并促进极化细胞中线粒体转运；融合可以增加线粒体ATP的产生，并防止正常线粒体被自噬体吞噬。
巨噬细胞和线粒体都是当下研究的热点，但线粒体的裂变/融合对巨噬细胞的代谢重编程、极化和功能的影响尚不清楚，因此研究两者之间的关系对理解巨噬细胞的功能有重要的意义。
研究背景
Research Background
代谢能为巨噬细胞的活化和引发所需的免疫反应提供协同支持，然而协调巨噬细胞活化的代谢途径目前知之甚少。视神经萎缩蛋白1（OPA1）是一种线粒体形成蛋白，控制线粒体融合、嵴生物发生和呼吸作用进行。此外，OPA1还有助于控制成纤维细胞、心肌细胞和中性粒细胞中细胞死亡、增殖和基因表达的调节，并通过控制线粒体重新分布和形状重排来调节淋巴细胞的运动。
尽管OPA1在中性粒细胞和T细胞等免疫细胞的功能发挥中起着重要作用，但它是否参与巨噬细胞的反应目前仍不清楚。
研究成果
Research results
2022年10月28日，意大利帕多瓦大学Antonella Viola和Barbara Molon等在Cell death and differentiation（IF=12.067）杂志上发表了题为“OPA1 drives macrophage metabolism and functional commitment via p65 signaling”的文章。在该研究中，作者阐释了OPA1在巨噬细胞活化中起着至关重要的作用。巨噬细胞中OPA1的缺失导致其信号传导、代谢适应和功能极化受损，并导致损伤时肌肉再生的显著延迟，这表明OPA1是巨噬细胞功能的关键代谢驱动因素。
原文链接：DOI号 10.1038/s41418-022-01076-y
研究过程与结果
Research Process and Results
1.OPA1缺失引起线粒体功能障碍
为了研究OPA1在巨噬细胞功能中的作用，作者构建了骨髓OPA1条件敲除小鼠（OPA1M/M），并通过WB和qPCR检测了骨髓源性巨噬细胞中OPA1的成功敲除（图1A-B）。电镜观察也发现OPA1缺失的巨噬细胞线粒体形态破碎、嵴增大但数量减少（图1C），这些形态的变化也伴随着线粒体功能障碍，如线粒体膜电位在寡霉素的处理下显著下降（图1D），暗示OPA1缺失巨噬细胞的线粒体中ATP合酶以反转模式运行以维持膜电位从而补偿线粒体功能障碍。同时，这些细胞的细胞耗氧率（OCR）和细胞内ATP水平降低，而线粒体ROS水平升高（图1E-G）。尽管，OPA1M/M巨噬细胞的糖酵解增强，但它们在含半乳糖/无葡萄糖的培养基中存活率降低（图1H-I），这也反映了线粒体的功能障碍。
另外，在线粒体功能障碍的情况下OPA1M/M巨噬细胞呼吸链超复合体的组装也存在缺陷（图2）。以上结果表明OPA1缺失会引起骨髓源性巨噬细胞的线粒体结构受损及功能障碍，并导致呼吸作用的减弱。
图1.OPA1缺失引起巨噬细胞线粒体功能障碍
图2.OPA1缺失影响线粒体呼吸链超复合物组装
2. OPA1缺失影响巨噬细胞极化
为了探究OPA1缺失对巨噬细胞极化的影响，作者在体外水平分别用LPS+IFNγ或IL-4来促进巨噬细胞向M1型或M2型分化，并检测相应标志物的表达水平。qPCR和WB结果表明相比于对照组，OPA1M/MM1型巨噬细胞促炎基因il-6、Tnf、Nos2的表达量显著下调，且IL-6和TNF的释放量以及NO水平都显著降低（图3A-F），暗示OPA1缺失导致M1型巨噬细胞功能不全。相反，OPA1M/M M2型巨噬细胞典型的抗炎标记物Mrc1、Arg1和Retnla的表达量则显著上调（图3G-L）。
接下来，作者研究了OPA1缺失引起巨噬细胞M1和M2表型失衡的分子机制。NF-κB是在巨噬细胞中响应LPS刺激表达促炎因子的关键驱动因子，而IKK是激活典型NF-κB途径的一种激酶。作者发现相比对照组，OPA1M/M M1型巨噬细胞在LPS处理后IKK磷酸化的水平更低（图4A-B）。相应的，NF-κB和p65亚基的核转位也下降了（图4C-D）。以上结果表明OPA1缺失引起NF-κB激活障碍，并导致巨噬细胞极化改变和M1型与M2型失衡。
图3.OPA1缺失影响巨噬细胞极化
图4.OPA1缺失抑制巨噬细胞中NF-κB活化
3. OPA1缺失通过改变TCA循环影响巨噬细胞M1/M2失衡
通常，M1型巨噬细胞依靠有氧糖酵解消耗葡萄糖和谷氨酰胺来产生ATP，而M2型巨噬细胞则倾向于通过氧化代谢尤其是FAO来作为ATP来源。据报道，TCA循环的中间产物对巨噬细胞的代谢和功能发挥有着重要的驱动作用，并且在M2型巨噬细胞中α-酮戊二酸与胞外琥珀酸（αKG/succinate）的比例要高于M1型。与此一致的是，作者在OPA1M/M巨噬细胞中检测除了相比对照组更高的αKG/succinate比例（图5A-B），这可能会在抑制巨噬细胞的NF-κB通路。同时，当用不含谷氨酰胺和富含琥珀酸二甲酯的培养基培养巨噬细胞时，巨噬细胞的分化标记物水平接近对照组，且NF-κB重新被激活（图5C-F）。以上结果表明OPA1缺失通过抑制NF-κB通路引起线粒体能量代谢及TCA循环变化而导致巨噬细胞M1/M2失衡。
图5.OPA1M/M巨噬细胞NF-κB活化受阻导致代谢改变
4. OPA1缺失影响肌肉再生
巨噬细胞在肌肉组织的损伤后修复中起到重要的作用，而最近的研究表明肌肉损伤后增加M1型巨噬细胞的数量可以促进肌肉恢复、减少纤维化。作者通过向小鼠的腓肠肌和股四头肌中注射心脏毒素（CTX）诱导肌肉损伤，在肌肉损伤后修复14天之后观察到OPA1M/M小鼠中肌肉明显的形态变化，包括纤维的大小、更多的胶原沉积以及巨噬细胞的滞留（图6A-E）。同样地，在肌肉损伤后修复7天时，OPA1M/M小鼠肌肉中也表现出更多的巨噬细胞数量、更高的M2型巨噬细胞标记物（CD206）水平以及显著的Nos2表达下调和Arg1表达上调（图6F-I）。以上结果表明OPA1缺失的小鼠肌肉损伤后修复的过程明显延迟且纤维化更加严重，肌肉再生受阻。
图6. OPA1缺失影响肌肉再生
研究总结
conclusions
在过去的报道中，许多研究指出线粒体动力学在调节先天性免疫和适应性免疫反应中起到关键作用，并重点强调它们对支持相关免疫细胞能量需求上的重要性。在本研究中，作者发现巨噬细胞中的OPA1缺失能通过抑制NF-κB通路影响TCA循环通量从而损害巨噬细胞的信号传导、代谢适应并引起M1型和M2型极化失衡，最终导致肌肉损伤后修复的显著延迟。
鉴于巨噬细胞在免疫反应中的重要性，作者的研究为OPA1作为先天免疫的主要调节因子提供了进一步的证据，并为控制炎症性疾病的治疗方法提出了新的策略。
转自：“学术查”微信公众号
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