胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editors, CBEs)能高效地产生精确的C·G -T·A碱基转换，但激活诱导的胞嘧啶脱氨酶/载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样(AID/APOBEC)蛋白家族脱氨酶成分会产生大量脱靶效应和插入缺失。
2022年11月10日，华东师范大学李大力、刘明耀团队与北京大学伊成器团队合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为“Re-engineering the adenine deaminase TadA-8e for efficient and specific CRISPR-based cytosine base editing ”的研究论文，这项研究通过对腺嘌呤脱氨酶TadA-8e重新设计改造，创新性地构建了一系列不依赖天然胞嘧啶脱氨酶家族的“精准且安全”的新型胞嘧啶碱基编辑器—TadA-derived CGBE/CBEs (Td-CGBE/Td-CBEs)，其中Td-CGBE能高效精确地诱导C到G的转换，进一步的分子进化获得了与BE4max活性相当但编辑窗口更窄的Td-CBEs系列。
重要的是，消除了固有的腺嘌呤脱氨酶活性的新型CGBEs/CBEs，展现出非常低的indel效应。此外，Td-CGBE/Td-CBEs在细胞或小鼠胚胎中均聚胞嘧啶位点产生精确编辑时效率更高，表明其在基因治疗和其他应用中的准确性和安全性。
碱基编辑器由核酸酶受损的Cas9和脱氨酶模块组成，在缺乏供体模板的情况下，可以产生位点特异性的碱基转换，而不诱导DNA双链断裂。碱基编辑器主要有两种类型:胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors, CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)，它们分别催化C·G到T·A和A·T到G·C的转变。通过Cas9 nickase (Cas9n)与活化诱导的胞嘧啶脱氨酶/载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样(AID/TadA-8e)蛋白家族的融合，CBE通常产生大量的C到G或C到A的副产物，因为U:G错配被尿嘧啶DNA N-糖基化酶(UNG)识别和切除，以创建一个碱性中间体，启动碱基切除修复，诱导不可预测的碱基转换。与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合或同时表达可显著提高CBE诱导的C·G-T·A转化的效率和纯度。
如果UGI被UNG或CBE主干中的DNA修复蛋白所取代，则C-to-G碱基编辑器(C-to-G base editors, CGBEs)主要诱导胞嘧啶碱基的转位。CBE/ CGBE是广泛应用的有前途的工具，同时它们产生大量的内嵌、旁边编辑和Cas9独立的DNA和RNA脱靶编辑，这引起了安全性问题，特别是在临床应用中。一些研究已经开发了更精确的CBE变体，如BE4max-YE1/YEE, eA3A-BE4max等，通过工程的APOBEC酶。
与CBE/ CGBE不同，ABEs使用一种非自然的腺嘌呤脱氨酶，由大肠杆菌中的一种转移RNA (tRNA)腺嘌呤脱氨酶TadA进化而来，以非常高的产物纯度(超过99.9%)、最小的内链和相对紧凑的编辑窗口诱导DNA中的A - G转换。最近的研究表明，ABEs还能独立于腺嘌呤转换，诱导已定义的TC*N基序(星号表示要编辑的靶胞嘧啶(C)和' T '和' N '作为相邻碱基)的胞嘧啶取代，这表明进化的TaDA具有进化的胞嘧啶脱氨基能力。
最近的研究还注意到ABE8e，一种超活性的ABE变体，包含TadA-8e脱氨酶，显示出胞嘧啶脱氨酶活性的增加。受到其出乎意料的胞嘧啶脱氨酶活性鉴定的启发，我们试图重新利用腺嘌呤脱氨酶TadA-8e，最有效的TadA变体，成为一种纯非自然的胞嘧啶脱氨酶。我们认为TadA-8e衍生的CBE比基于AID/ APOBEC的编辑器有潜在的优势，因为原始的ABEs表现出最小的indel频率和无法检测到cas9独立的DNA脱靶编辑
这项研究重新利用腺嘌呤脱氨酶TadA-8e进行胞嘧啶编辑。研究人员在TadA-8e中引入N46L变体消除了其腺嘌呤脱氨酶活性，开发了TadA-8e衍生的C-G碱基编辑器(TadA-8e-derived C-to-G base editor, Td-CGBE)，能够高效和精确地进行C·G - G·C编辑。
通过与尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合和进一步引入其他变体，获得了一系列Td-CBEs，它们有的具有与BE4max相似的高活性，有的与其他报道的精确CBE相比具有更高的精密度。Td-CGBE/Td-CBEs显示非常低的indel效应和背景水平的Cas9依赖或Cas9独立的DNA/RNA脱靶编辑。此外，研究人员应用Td-CGBE/ Td-CBE在致病性复杂均聚胞嘧啶序列中安装所需突变，以生成或校正疾病模型。
TadA-8e衍生的Td-CGBE编辑器（图源自Nature Biotechnology ）
总的来说，该研究从TadA-8e腺嘌呤脱氨酶中开发了一系列不同的胞嘧啶编辑器Td-CGBE和Td-CBE。它们不仅是不利用脱氨酶的AID/APOBEC家族的胞嘧啶编辑器，而且具有独特的优势，如最低的indel率，大大减少了周围突变和cas9独立的DNA和RNA脱靶效应的背景水平。由于Td-CGBE和Td-CBE能够在体内外不需要序列背景的情况下，在同聚胞嘧啶位点高效地产生单胞嘧啶转换，因此它们是有前景的精准编辑器，扩大了与PAM - relaxation Cas9变异体融合后精准碱基转换的靶向范围，用于广泛的应用。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01532-7
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