科研进展
研究背景 | Research background
二苯甲酮和呫吨酮是具有C6-C1-C6碳骨架的两类多酚化合物，由于其光物理特性，在工业和医药领域被广泛应用。在自然界中，二苯甲酮和呫吨酮广泛存在于细菌、真菌和植物中，但是这两类化合物中的绝大多数(约80%)主要是从植物中分离出来的。藤黄属(Clusiaceae)树木的可食用果实中富含二苯甲酮和呫吨酮，在东南亚的一些国家，藤黄果和山竹(水果皇后)是非常受欢迎的水果，对人体的健康有益，当地人食用这些水果用于减肥、治疗腹泻等疾病。
大叶藤黄果实
藤黄植物中的二苯甲酮和呫吨酮，其结构骨架通过在多个位置进行羟基化、异戊二烯等功能修饰生成各种复杂的结构，如二苯甲酮衍生物 garcinol 和 oblongifolin C；呫吨酮衍生物gambogic acid和 α-mangostin (图1)，这些化合物已被提议作为新型抗癌药物的探针，是潜在的高效低毒抗肿瘤药物。并且它们还具有广泛生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗病毒、抗寄生虫、抗炎特性。
据已有的文献分析，二苯甲酮是呫吨酮的前体，二苯甲酮通过分子内环化生成呫吨酮，然而，藤黄属植物中大部分二苯甲酮类化合物(如garcinol, oblongifolin A)在结构上并没有分子内环化，虽然也经历了多种功能修饰，但保持其基本的二苯甲酮骨架，这说明植物中或许存在着一种羟基化酶，可以控制开环或闭环反应，决定C6-C1-C6碳骨架生成二苯甲酮或呫吨酮两种不同类型的化合物。
图1. 藤黄属植物二苯甲酮和呫吨酮的代谢途径
2022 年 10 月25日，催化领域Top期刊ACS Catalysis在线发表了中国科学院分子植物科学卓越创新中心Tatsis研究组题为“Decoding the cytochrome P450 catalytic activity in divergence of benzophenone and xanthone biosynthetic pathways”的研究论文。该研究基于转录组和代谢组学分析，以及生化实验首次解析了决定二苯甲酮和呫吨酮合成的关键基因，通过蛋白质理性设计，构建了不同位阻碍活性口袋的蛋白酶突变体，提高了酶催化效率，保证了的定向产物的酶促合成。
研究内容 | Research content
研究人员首先通过对5种不同藤黄属植物中山竹子素(Garcinol)含量的分析，选择大叶藤黄建立转录组数据库(图2)，以用于发现作用于二苯甲酮的羟基化酶。以鉴定并表达的二苯甲酮基因BPS为诱饵，通过自组织映射和层次聚类的共表达分析，筛选下游潜在控制开环闭环反应的羟基化酶，并通过异源表达纯化蛋白鉴定了3个细胞色素P450酶，其中CYP1(GxCYP81AA4)催化底物发生分子内环化，是二苯甲酮转变为呫吨酮的关键酶；CYP10(GxCYP71AH51)具有呫吨酮-6-羟基化活性(X6H)，酶活反应生成的1,3,6,7-四羟基呫吨酮是绝大多数呫吨酮类化合物的代谢前体，曾有研究在植物组织研磨液中发现X6H活性，这里的CYP10是第一个报道具有X6H活性的基因(图1)。
图2. Garcinol在藤黄属植物样品粗提物中的定量分析
研究中报道的CYP3(GxCYP81AA5)是具有双功能的酶，催化底物2,4,6-triHB的C(3’)和C(4’)处的两个串联的羟基化反应(图3,4)，此时底物并不发生分子内环化反应，产物为2,3',4,4',6-五羟基二苯甲酮，维持了二苯甲酮基本的骨架。由于藤黄属植物中富含大量的Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinol，PPAP(多环多异戊烯基酰基间苯三酚)化合物，前体2,3',4,4',6-五羟基二苯甲酮是PPAP化合物的重要前体，因此CYP3的鉴定和发现对于后续开发利用PPAP化合物具有里程碑的意义。
图3. GxCYP81AA5催化的两个串联的羟基化反应
研究人员通过基因序列比对发现CYP1和CYP3具有高度同源性，虽然质谱分析结果表明这两种酶的产物有所交叉，但其对应主产物仍是二苯甲酮或呫吨酮。为了探究细胞色素P450作用于二苯甲酮底物的作用机理，研究人员应用建模工具Alphafold2构建了CYP3蛋白的三维结构。通过CYP3底物识别位点和分子对接实验，确定了酶活性口袋中影响酶与底物结合构效的关键残基V375，通过理性设计将其突变成侧链位阻较小的丙氨酸，使得酶底物活性口袋容积扩展，底物翻转，发生分子内环化生成呫吨酮，而当其突变成侧链位阻较大的亮氨酸时，口袋变小底物被限制在特定结合区域，底物只发生两部串联的羟基化生成双羟基二苯甲酮。
图4. 酶CYP3催化两步串联反应的假设
此外，研究人员还发现S479和K480这两个位点可能是底物进入通道的重要组成部分，进一步通过对这两个位点进行人工改造，实现了该蛋白的功能优化，使得酶活力及催化效率得到了明显的提升，最终实现了底物催化生成特定产物，为该类酶的后续改造与应用研究奠定了良好的基础。
转自：“iPlants”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
