导读
背景：养血清脑丸（YXQNW）是一种复方中药，在我国已被广泛用于治疗血虚肝亢引起的头晕、烦躁、失眠、多梦等症状。然而，目前尚不清楚YXQNW是否能抑制组织纤溶酶原激活剂（tPA）处理后血脑屏障（BBB）损伤引起的脑微血管渗出和脑出血（CH）。本研究观察YXQNW对tPA处理后脑微血管渗出和CH的影响，探讨其保护血脑屏障的机制。
材料和方法：雄性C57BL/6 N小鼠在氯化铁刺激下颈动脉血栓机械剥离，造成缺血性脑卒中。然后用tPA（10 mg/kg）以及YXQNW（0.72 g/kg）在4.5 h进行处理。tPA处理后24 h评估了脑血流量（CBF）、梗死面积、存活率、神经功能评分、步态分析、伊文思蓝外渗、脑含水量、异硫氰酸荧光素标记的白蛋白渗漏、出血、连接和基底膜蛋白表达、白细胞粘附和基质金属蛋白酶（MMPs）表达。蛋白质组学用于鉴定靶蛋白。
结果：YXQNW抑制tPA溶栓后的脑梗死、神经行为缺陷、生存率下降、伊文思蓝渗漏、白蛋白渗漏、脑含水量和CH；改善CBF、逆转连接蛋白、基底膜蛋白、Arhgap21及其下游α-连环蛋白和β-连环蛋白的低表达和降解；并抑制粘附白细胞的增加和巨噬细胞释放MMP-9。
结论：YXQNW减轻tPA溶栓后血脑屏障损伤，减轻脑微血管渗出和CH。YXQNW对脑微血管渗出的影响与抑制连接蛋白特别是Rho-GTPase激活蛋白21（Arhgap21）介导的AJs低表达有关，而对CH的影响与抑制白细胞粘附、巨噬细胞来源的MMP-9释放以及血管基底膜中IV型胶原和层粘连蛋白的低表达和降解有关。
图文摘要
论文ID
原名：YangXueQingNaoWan attenuated blood brain barrier disruption after thrombolysis with tissue plasminogen activator in ischemia stroke
译名：养血清脑丸减轻缺血性脑卒中组织纤溶酶原激活物溶栓后血脑屏障破坏
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.8
通讯作者：韩晶岩
通讯作者单位：北京大学医学部基础医学院
实验设计
实验结果
1. YXQNW促进tPA处理后小鼠脑血流量(CBF)的恢复
为了研究YXQNW对供血效应的影响，在以下不同时间点记录CBF：基线，缺血性脑卒中后10 min，4.5 h、 5.5 h、 6.5 h、和28.5 h（图1A）。与假手术组相比，血栓组在缺血后CBF显著降低，血栓+YXQNW、血栓+tPA和血栓+tPA+YXQNW组也观察到了这一点。YXQNW仅在28.5 h部分逆转了tPA诱导的CBF的减少（图1B）。
图1 YXQNW促进小鼠tPA处理后CBF的恢复。（A）各组在基线、10分钟、4.5小时、5.5小时、6.5小时和28.5小时的CBF代表性图像。（B）CBF对小鼠上述时间点的统计分析（N＝8）。与假手术组相比，*P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。
2. YXQNW改善tPA处理后小鼠梗死体积、存活率、神经功能缺损和步态分析
缺血性卒中后，通过TTC测量脑梗塞（图2A）。血栓组与假手术组相比有明显的梗死灶。tPA处理后损伤加重。然而，YXQNW显著减弱了tPA增加的梗塞（图2B）。
然后，我们评估了YXQNW对生存率、神经功能缺损和步态分析的影响（图2C–J）。血栓组的存活率在24h时为75%，但由于服用tPA（50%）而恶化。血栓+tPA+YXQNW组的存活率为68.75%（图2C）。tPA后24h用mNSS和NES测试神经功能缺损 ，结果显示，与血栓组相比，tPA组小鼠在mNSS和NES方面的得分明显较差，而YXQNW减轻了tPA诱导的神经功能缺损（图2D–E）。此外，测量步态行为以评估YXQNW的效果（图2F–J）。与假手术组相比，缺血动物的前跨步距离更短。tPA的使用加重了损伤，YXQNW抑制了损伤。血栓和血栓+tPA组小鼠的后爪步宽较假手术组更宽，YXQNW可改善tPA引起的后爪步宽。另一种步态模式（后跨步、前爪步宽）没有显著差异。
图2 YXQNW改善小鼠tPA后的梗死体积、存活率、神经功能缺损和行为测试。（A）TTC染色前后五个冠状切片的代表性图像。梗死组织呈白色，而正常组织呈红色。（B）小鼠脑梗塞体积的统计分析（N=6）。（C）各组24小时生存率（N=16）。（D）mNSS评分的统计结果。（E）NES评分的统计结果（N=12）。（F）每组小鼠步态轨迹的代表性图像。四个参数用于测量步态：前跨步（红色实线）、后跨步（蓝色实线）、前爪步宽（红色虚线）和后爪步宽（蓝色虚线）。（G–J）前跨步、后跨步、前爪步宽和后爪步宽的统计分析（N=9）。与假手术相比，*P < 0.05；与血栓组相比，#P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。
3. YXQNW减少tPA处理后小鼠脑微血管渗出和CH
小鼠血脑屏障通透性主要通过伊文思蓝外渗、脑含水量、白蛋白渗漏和出血来评价。如图3A–B所示，血栓组仅有少量伊文思蓝渗出物。tPA溶栓后，外渗加重并伴有明显出血，YXQNW可减轻出血。评估脑含水量以反映缺血性卒中后脑水肿的程度。与假手术组小鼠相比，血栓组小鼠脑含水量增加，但无统计学意义。然而，与假手术组和血栓组相比，tPA显著加重了脑水肿，YXQNW改善了这种情况（图3C）。
如图3D–E所示，我们在所有组中都检测到来自小鼠脑小静脉的FITC标记的白蛋白渗漏。结果表明，与假手术组相比，脑卒中后白蛋白渗漏显著增加。tPA增加了白蛋白渗漏，而YXQNW减弱了白蛋白渗漏。CH通过血红蛋白测定法测定。定量结果显示，在患有血栓的小鼠中，tPA诱导的出血被YXQNW抑制（图3F）。这些结果表明，YXQNW的使用部分逆转了脑微血管渗出和CH。
图3 YXQNW可减少tPA处理后小鼠脑微血管渗出和CH。（A）每组缺血24小时后伊文思蓝外渗的代表性图像。（B）分光光度法测定伊文思蓝外渗的统计分析（N=8）。（C）每组缺血24小时后右半球脑含水量的定量分析（N=7）。（D）小鼠脑小静脉中FITC标记的白蛋白渗漏的代表性图像。小静脉中的荧光强度用Iv表示，而间质区域用Ii表示。（E）FITC标记的白蛋白渗漏的统计分析（N=8）。（F）各组用比色测定试剂盒测定脑出血的统计分析（N=7）。与假手术相比，*P < 0.05；与血栓组相比，#P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。
4. YXQNW抑制小鼠tPA后TJs和AJs的降解和低表达
通过免疫荧光法评估闭合蛋白（Occludin）和血管内皮细胞钙黏蛋白（VE-Cadherin）的降解，探究内皮细胞连接在血脑屏障调节中的作用。免疫染色结果显示，tPA导致Occludin和VE-Cadherin的不连续性和降解，被YXQNW减弱（图4A）。免疫印迹法检测皮质中Occludin、VE-Cadherin、Claudin-5、JAM-1和ZO-1的表达。结果显示，与假手术组相比，血栓组中Occludin、Claudin-5、JAM-1和VE-Cadherin的表达较低，但除ZO-1外没有显著差异（图4B–G）。tPA后连接蛋白的低表达进一步加剧，YXQNW可阻止这种情况的发生。因此，tPA降低了紧密和粘附连接的表达，而YXQNW可逆转这种表达。
图4 YXQNW抑制小鼠tPA后TJs和AJs的降解和低表达。（A）Occludin和VE-Cadherin免疫荧光染色的代表性图像。Hoechust（蓝色）染色定位于vWF（绿色）细胞核标记的内皮细胞之间的Occludin（红色）和VE-Cadherin（红色）。（N＝3）。（B）各组右半球Occludin、VE-Cadherin、Claudin-5、JAM-1和ZO-1蛋白表达的代表性图像。（C–G）Occludin、VE-Cadherin、Claudin-5、JAM-1和ZO-1蛋白表达的统计分析。（N＝7），与假手术相比，*P < 0.05；与血栓组相比，#P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。
5. 蛋白质组学分析通过非标签定量（LFQ）鉴定DEPs
LFQ蛋白质组学检测假手术组、血栓+tPA组和血栓+tPA+YXQNW组蛋白质表达的变化。热图是基于各组之间蛋白质的表达水平绘制的（图5A）。血栓+tPA组和血栓+tPA+YXQNW组共有77个DEPs，其中27个蛋白上调，50个蛋白下调。簇1和簇2分别表现出蛋白质的高-高-低和低-低-高的趋势。而簇3显示出蛋白质的高-低-高趋势（图5D）。KEGG途径主要包括辅因子的生物合成、铁死亡、产热、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径、核质转运和白细胞跨内皮迁移（图5B）。此外，DEPs的火山图显示上调和下调的蛋白质（图5C）。
图5 蛋白质组学分析通过LFQ鉴定DEPs。（A）假手术组、血栓+tPA组和血栓+tPA+YXQNW组的DEPs热图。DEPs的簇由三种不同颜色（绿色、红色、蓝色）的虚线框表示。（B）DEPs的KEGG通路图。Y轴表示KEGG特定通路的名称。X轴表示参与特定途径的蛋白质数量。（C）血栓+tPA和血栓+tPA+YXQNW组之间DEPs的火山图。红点：代表上调的DEPs；蓝点：表示下调的DEPs；灰点：表示不变的蛋白质。（D）层次聚类根据相似性表现出明显的组差异。
Rho GTP酶激活蛋白21（Arhgap21）和Ras抑制蛋白1（Rsu1）是主要的上调蛋白，它们与细胞-细胞连接和白细胞跨内皮迁移有关。因此，我们通过免疫印迹检测脑组织中Arhgap21和Rsu1的表达。结果表明，YXQNW逆转了血栓+tPA组中Arhgap21的低表达，而Rsu1的表达没有显著差异（图6A–D）。α-连环蛋白和β-连环蛋白是Arhgap21的下游，我们还观察到它们的表达变化与Arhgap21一致（图6E–H）。
图6 YXQNW抑制小鼠tPA后Arhgap21、Rsu1、α-连环蛋白和β-连环蛋白的低表达。（A）各组右半球Arhgap21、Rsu1（B）、α-连环蛋白（E）和β-连环蛋白（F）的蛋白表达的代表性图像。对Arhgap21（C）、Rsu1（D）、α-连环蛋白（G）和β-连环蛋白（H）的蛋白表达进行统计分析。N=6–7，与假手术相比，*P < 0.05；与血栓组相比，#P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。
6. YXQNW抑制tPA处理后的小鼠白细胞粘附和巨噬细胞来源的MMP-9活化
如图7A–B所示，在所有组中都检测到小鼠脑小静脉中的罗丹明6G标记的白细胞粘附。结果表明，与假手术组相比，缺血性脑卒中后粘附在小静脉壁上的白细胞数量显著增加。tPA处理增强了这一趋势，而YXQNW减少了粘附的白细胞数量。I/R导致MMPs的分泌。双重免疫荧光染色显示，MMP-9主要来源于CD18染色的白细胞，尤其是CD68标记的巨噬细胞，而不是vWF标记的内皮细胞（图7C–D）。此外，YXQNW抑制巨噬细胞分泌MMP-9。
图7 YXQNW抑制小鼠tPA处理后白细胞粘附和巨噬细胞衍生的MMP-9的激活。（A）小鼠脑小静脉中由罗丹明6G标记的粘附性白细胞的代表性图像。白色箭头表示白细胞粘附在小鼠脑内的小静脉壁上。（B）粘附性白细胞的统计分析（N=8）。与假手术相比，*P < 0.05；与血栓组相比，#P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。（C）通过共聚焦显微镜进行的双重免疫荧光标记显示，在血栓+tPA和血栓+tPA+YXQNW组（D）中，MMP-9（红色）与vWF（内皮细胞标记，绿色）、CD18（白细胞标记，红色）和CD68（巨噬细胞标记，绿色）共定位。核酸被染成蓝色。（N＝3）。
7. YXQNW改善小鼠tPA处理后基底膜的降解和低表达
为了检查血管壁的完整性，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹来评估血管基底膜。如图8A所示，tPA诱导小鼠IV型胶原和层粘连蛋白的降解，在添加YXQNW后部分阻止了降解。蛋白质印迹的结果显示出与免疫荧光染色相同的趋势（图8B–E）。MMPs通常导致连接膜和基底膜蛋白的降解，这是CH的原因。免疫印迹表明，tPA诱导了MMP-9的表达，而不是MMP-2的表达，这被YXQNW抑制（图8F–H）。
图8 YXQNW改善小鼠tPA处理后基底膜的降解和低表达。（A） IV型胶原（第一行）和层粘连蛋白（第二行）的免疫荧光染色的代表性图像。胶原IV和层粘连蛋白染色为红色，细胞核染色为蓝色。各组小鼠右半球胶原IV（B）、层粘连蛋白（C）、MMP-2和MMP-9（F）的蛋白质表达的代表性图像。Ⅳ型胶原（D）、层粘连蛋白（E）、MMP-9（G）和MMP-2（H）蛋白表达的统计分析。（N=6–7）。与假手术相比，*P < 0.05；与血栓组相比，#P < 0.05；与血栓+tPA相比，&P＜0.05。
讨论
本研究结果表明，YXQNW改善了CBF、存活率和神经行为缺陷，减少了脑梗死、伊文思蓝和白蛋白渗漏、出血、白细胞粘附和MMP-9的表达，并抑制了连接蛋白和基底膜蛋白的低表达和变性，部分解释了YXQNW对血脑屏障的保护作用。
众所周知，血管闭塞后外源性给予tPA与血脑屏障的破坏、内皮通透性的增加和脑水肿有关。TJs、AJs和血管内皮细胞基底膜在维持血脑屏障通透性中起重要作用。脑微血管渗出，尤其是白蛋白，受血管内皮细胞间连接介导的细胞旁通路的调节。我们之前已经表明，CG通过阻止TJs的降解和抑制内皮细胞中小窝蛋白1（caveolin-1）的表达，降低了大脑中动脉闭塞大鼠的血脑屏障通透性和脑水肿。此外，YXQNW恢复了自发性高血压大鼠受损的能量代谢和血脑屏障完整性。然而，目前尚不清楚YXQNW是否能抑制tPA处理后的血脑屏障损伤，并减轻脑微血管渗出和CH。tPA引起脑微血管渗出，表现为血浆白蛋白、伊文思蓝的渗漏和脑含水量的增加，而YXQNW在tPA溶栓后可逆转。YXQNW通过抑制TJs和AJs的低表达，特别是Arhgap21介导的AJs来维持其作用。
过去的研究主要集中在MMPs引起的脑血管内皮细胞间TJs的降解。在中风的早期，通常在数小时至数天内，MMPs降解TJs和基底层蛋白，导致血脑屏障破坏、脑水肿、神经元细胞死亡和出血。CH的病理基础是血管基底膜损伤。研究表明，tPA具有增加MMPs，特别是MMP-2、MMP-3和MMP-9的表达和激活的潜力。MMP-2和MMP-9降解IV型胶原和层粘连蛋白破坏血管基底膜。在这项研究中，tPA确实诱导了缺血小鼠中MMP-9的释放，但没有诱导MMP-2的释放。此外，免疫荧光染色证实MMP-9与浸润到大脑中的CD18和CD68阳性细胞共定位，表明CD18阳性细胞（中性粒细胞）和CD68阳性细胞（巨噬细胞）释放MMP-9。YXQNW对CH的作用与其抑制粘附和浸润的白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞分泌MMP-9以及降解基底膜中的IV型胶原和层粘连蛋白有关。
蛋白质组学结果显示DEPs参与白细胞跨内皮迁移和连接蛋白表达。Arhgap21是多种过程中的一种重要蛋白，尤其是与肌动蛋白细胞骨架相连的过程，包括迁移、粘附、细胞内运输和胰岛素分泌，是连接形成和VE-Cadherin上游所必需的。它在促进α-连环蛋白向粘附连接的募集方面具有关键功能，使α-连环素能够连接到血管内皮钙黏附素-β-连环蛋白复合物。在本研究中，YXQNW逆转了tPA处理小鼠中Arhgap21、α-连环蛋白和β-连环蛋白的低表达。这一结果表明，Arhgap21介导的AJs可作为减轻tPA后YXQNW脑微血管渗出的治疗靶点。此外，最近的研究报告称，Arhgap21可能通过调控细胞骨架重排在调节血小板的产生和功能中发挥关键作用。与野生型相比，Arhgap21敲除小鼠减少了尾部出血时间，加速了氯化铁对颈动脉损伤后血栓的形成，这暗示了其在凝血和出血中的可能作用。后续还需要进一步研究Arhgap21在tPA后CH中的作用。蛋白质组学还鉴定了Rsu1，它在细胞粘附、细胞骨架重塑和细胞迁移中发挥着重要作用。然而，Rsu1的蛋白质印迹结果在不同组之间没有显著差异。
几项研究已经提供了关于YXQNW和养血清脑颗粒（CG，与YXQNW相同的草药，不同剂型）的药代动力学信息。由于它是一种复方中药，由多种成分组成。不同成分之间的相互作用也会影响药物的作用。研究发现，CG的六种活性成分原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸和芍药苷存在于吸收到血液中的GC中，口服后可检测到。因此，制药公司通常利用四氢巴马汀作为代表性化合物来证明YXQNW的吸收、分布、代谢和排泄特性。YXQNW在血浆中的半衰期（t1/2）为7.22 ± 2.03 h、 而整个配方的半衰期（t1/2）为4.45 h。芍药苷是一种主要的活性成分，可作为植物化学标志物用于质量控制。在一项比较CG和阿司匹林治疗急性脑卒中神经功能障碍的对照试验中，脑卒中患者服用2.5 g装CG，每天三次。所用剂量与YXQNW相同。主要不良反应为轻度恶心和呕吐。临床试验中未报告严重不良事件。说明书中记录的不良事件包括恶心、呕吐和皮疹。
尽管药物（烟酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸、苔藓抑素、孕酮、转化生长因子-β1、米诺环素、尿酸、他汀类药物、依达拉奉和芬戈莫德）在tPA处理的临床前研究中显示出益处，但还需要更严格和谨慎的临床试验来验证其效果和安全性。YXQNW，经中国国家食品药品监督管理局批准（Z20063808），在中国广泛用于治疗慢性脑循环不全头晕、易怒、失眠和多梦。临床评价了YXQNW和CG的安全性和有效性。此外，大多数药剂都是具有单一活性成分的化学药物，靶向单一作用部位。YXQNW是一种含有多种有效成分的复方中药。复杂的成分作用于复杂的靶点，以复杂的机制治疗疾病，这也许是复方中药的优势所在。
本研究建议YXQNW作为tPA溶栓的辅助治疗方法，以改善脑微血管渗出和CH。然而，还需要更多的研究来阐明YXQNW对溶栓后血脑屏障保护的详细机制。
结论
本研究表明，YXQNW可抑制tPA溶栓后血脑屏障损伤，减轻脑微血管渗出和CH。YXQNW对脑微血管渗出的抑制作用与其抑制TJs和AJs特别是Arhgap21介导的AJs的低表达有关，而对CH的抑制作用与抑制白细胞粘附、巨噬细胞来源的MMP-9的释放以及血管基底膜中IV型胶原和层粘连蛋白的低表达和降解有关。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123008929#fig5
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