Nature子刊 | 吉林大学李占军/隋婷婷/赖良学开发尺寸更小的Cas13

与不同效应域融合的Cas核酸酶的小尺寸使其具有广泛的功能。尽管有几种方法可以减小Cas核酸酶复合物的大小，但尚未证明有有效或可推广的方法可以实现蛋白质小型化。

2023年9月8日，吉林大学李占军、隋婷婷及赖良学共同通讯在Nature Communications发表题为“A strategy for Cas13 miniaturization based on the structure and AlphaFold”的研究论文，该研究建立了蛋白质小型化的相互作用，动态和保守（IDC）策略，并基于IDC策略和AlphaFold2的组合，生成了5个Cas13紧凑变异体，这些变异体具有与野生型酶相比的完全RNA结合和切割活性。

该研究构建了一个RNA碱基编辑器mini-Vx和一个携带mini-RfxCas13d和crRNA表达盒的单个AAV（腺相关病毒），分别显示了有效的转化率和RNA敲低活性。总之，这些发现强调了基于AlphaFold2预测的结构生成小型CRISPR/Cas13系统的可行策略，从而能够为基础研究和治疗应用靶向降解RNA和RNA编辑。

CRISPR-Cas系统已被开发为一种革命性的基因编辑技术，具有精确的靶向、高效率和可编程的DNA或RNA靶向特性。已被开发用于基础研究、治疗、核酸检测、诊断、成像和抗病毒应用。然而，由于腺相关病毒(aav)的体内递送受到限制，用于治疗应用的CRISPR-Cas编辑系统以及启动子、表达调节元件和其他功能蛋白仍然具有挑战性。小的Cas酶已经引起了相当大的关注，因为它们在广泛的应用中超越了蛋白质大小的限制。

以前的研究已经显示了几种用于小型化Cas蛋白的成功策略。一种有效的方法是在宏基因组数据集中搜索天然致密Cas酶。然而，这些紧凑的Cas蛋白并不能完全概括先前优化的Cas蛋白的优点。Cas13bts在RNA转录本敲低方面的效率低于RfxCas13d。在另一种小型化策略中，Cas酶的功能被修改。由于上述挑战，有必要制定体内基因治疗的小型化策略。

CRISPR-cas13系统被描述为一种crRNA介导的CRISPR核酸酶，专门靶向RNA，分为六种亚型，Cas13a-d，Cas13X和Cas13Y。在功能上，所有Cas13效应子都携带一个pre-crRNA加工催化中心和一个由两个保守的R-X4-H基序形成的靶RNA切割催化中心。

相互作用是指Cas酶功能位点之间的相互作用。Cas13酶表现出RNP形式的精确靶向切割，包括crRNA的结合以及靶RNA的结合、切割和释放。构象自由度描述了围绕天然构象和切换到功能状态的波动。在Cas13-crRNA-靶RNA三元复合物中，具有有效自由度的位点集中在crRNA-靶RNA接触位点、前crRNA加工位点和变构靶RNA切割位点。因此，研究选择了有效自由度最高的二级结构元作为观察相对域分布的研究对象。

动力学是指域内的构象变化。在crRNA结合和靶RNA结合时，结构域在转变过程中重新排列，导致结构域的整体构象发生特别明显的变化;值得注意的是，二级结构单元的域内重组变化较小。结构域的构象变化有助于整个蛋白质的构象变化，部分原因是蛋白质天然动力学的长期相关性以及蛋白质分子中其他空间远端残基可以感知的任何残基的局部扰动。此外，域单元的部分对于域功能不是必需的。在Cas13酶的域内重组过程中，具有低相关性和不太显着的功能构象变化作为研究对象的适用性的二级结构单元被删除。

保守性是指Cas13d蛋白家族的保守结构单位，以及该家族中蛋白质的结构特异性单位。根据AlphaFold2对结构的详细预测，确定了Cas13d蛋白家族中的保守结构单元和每个Cas13d同系物的独特结构单元。尽管序列同源性较低，但Cas13d蛋白家族成员的结构表现出非常高的相似性。对于保守的结构单元，分析的缺失片段可直接推广到整个Cas13d蛋白家族;对于特定Cas13d同系物的独特结构单元，进行相互作用和动力学分析以评估它们是否满足删除标准。此外，片段缺失原理与蛋白质序列的守恒无关;即使是具有高度保守序列的结构也可以考虑进行片段删除。

PspCas13b耐受多个结构域缺失，同时保持靶标结合和RNA敲低活性（图源自Nature Communications ）

本研究从蛋白质结构的角度出发，提出了一种基于核蛋白相互作用、动态构象重组和同源保守性的蛋白质小型化IDC策略。研究应用IDC策略生成Cas13蛋白的五个小型化变体，并验证Cas13的这些超小变体都介导了与WT蛋白相当的有效哺乳动物转录物敲低。此外，研究设计了一个由工程化ADAR和mini-RfxCas13d组成的紧凑RNA碱基编辑器，该编辑器相对于Vx表现出强大的编辑效率，并展示了在单个腺相关病毒中包装mini-RfxCas13d。此外，它有效地敲低了Pcsk9转录本表达。综上所述，通过结合结构分辨率和人工智能，该策略可以推广到整个Cas13蛋白家族。

参考消息：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-41320-8

转自：“iNature”微信公众号

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