[B.B. 南方科技大学马晓鹏课题组] 基于微流控平台的CRISPR/cas12a辅助等温扩增快速特异诊断呼吸道病毒

长期以来，呼吸道病毒一直是全球流行的主要原因，因此我们迫切需要一种高灵敏度的诊断工具。传统的PCR技术只能确定病毒类型，如果要检测同一病毒的不同变异株，就需要进行昂贵且耗时的基因测序。为了解决这个问题，南方科技大学的马晓鹏课题组研究了一种名为LOC-CRISPR的新技术，它基于CRISPR/Cas12a和等温扩增技术，是一种简单、全封闭、高度集成的微流控系统。LOC-CRISPR系统可以特异性地识别多种常见呼吸道病毒及其变异株。它的核心是LOC-CRISPR芯片，该芯片集成了病毒核酸提取、重组聚合酶扩增和基于CRISPR/Cas12a的检测反应，而且是无污染的。这个芯片设计用于多重检测，可以同时处理两个样本，并输出10个结果。它不仅可以检测到SARS-CoV-2、H1N1、H3N2、IVB和HRSV等病毒，还可以区分SARS-CoV-2的不同变异株，如BA.1、BA.2和BA.5。研究团队对50份鼻咽拭子样本进行了临床验证。结果显示，LOC-CRISPR系统具有良好的灵敏度（97.8%）和特异度（100%）。它能够快速、敏感且准确地检测多个靶点的单碱基突变核酸序列。这项技术的发展将进一步提高呼吸道病毒感染性疾病的快速识别和溯源能力。总而言之，LOC-CRISPR是一种新的诊断技术，它能够高效地检测呼吸道病毒及其变异株。通过集成关键的分析步骤，这个系统具备快速、敏感和准确的特点，将有助于更好地识别和追踪呼吸道病毒感染。

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图1  LOC-CRISPR系统核酸提取的验证与优化。

图2设计的RPA引物和荧光探针的验证，以及LOC-CRISPR系统条件的优化。

总而言之，在这项研究中，他们开发了一种新的检测系统，可以用于实时检测多种呼吸道病毒，包括H1N1、H3N2、IVB、HRSV、SARS-CoV-2和其变异株。这个系统非常简单、紧凑，并且完全封闭，被称为LOC-CRISPR微流控系统。使用这个系统，他们可以在60分钟内检测两个样本中的5个病毒目标，并且可以检测到呼吸道病毒目标浓度高于100拷贝/毫升的样本。通过对50个临床样本进行验证，研究结果显示该系统性能良好，具有100%的特异性和97.8%的敏感性。LOC-CRISPR系统的主要优点有以下几点：首先，它集成了高度集成化的芯片。核酸提取操作采用了磁分离技术，可以同时处理两个样本，并且由于磁体已经集成在芯片中并与核酸提取结构匹配，所以不需要额外的磁体控制系统。此外，微流控芯片上独特的微通道可以连续完成核酸提取、核酸扩增和CRISPR反应。其次，试剂成本低廉。与之前报道的微量核酸提取试剂不同，他们的核酸提取操作可以使用常规商业试剂，只需简单的浓度优化即可高效提取核酸。这确保了LOC-CRISPR系统具有成本效益，适用于感染筛查。第三，它是一种无污染的基于核酸的分子诊断方法。与之前报道的核酸诊断系统不同，他们的微流控芯片在一个封闭的空间中结合了核酸提取、RPA和CRISPR反应检测，最大限度地降低了与核酸转移相关的污染风险，简化了检测操作。目前，这个LOC-CRISPR系统还处于早期开发阶段。在未来的研究中，他们将进一步提高系统设备的集成程度和微流控的处理能力。他们计划开发自动化和程序化控制系统，以提高检测速度，进一步减少总体诊断时间。这项研究中提出的LOC-CRISPR系统结合了CRISPR-Cas系统的序列特异性识别能力和微流控技术的精准样本操作能力，为准确、敏感、可靠地分析呼吸道病毒感染患者的遗传信息提供了一种新的检测方法。这个系统还有望在鉴定其他感染性病原体和进行基因分型方面发挥作用。

论文题目：CRISPR/Cas12a-Assisted isothermal amplification for rapid and specific diagnosis of respiratory virus on an microfluidic platform

原文链接：https://doi. org/10.1016/j.bios.2023.115523.  

转自：“NANO学术”微信公众号

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