PBJ | 人工合成R基因，柑橘抗溃疡病的新途径：Xcc-TALE-trap

柑橘溃疡病（CBC）是由柑橘溃疡菌（Xanthomonas citri pv. citri，简称Xcc）引起的一种细菌性病害，对柑橘产业发展具有巨大破坏作用。病原菌在柑橘幼果期或新梢抽发期通过气孔、伤口等渠道侵染植物果实、叶片及枝梢。植株感染柑橘溃疡病菌后形成水渍状病斑，后期病斑逐渐木栓化并呈现火山口状。染病严重时可造成植株叶片和果实大量脱落，甚至导致植株死亡，影响果实品质，并造成大量减产，严重影响经济效益。病菌在叶、枝梢及果实的病部组织中越冬，翌年春条件适宜时从病部溢出，借风雨、昆虫和枝叶相互接触后短距离传播，经寄主的气孔、皮孔和伤口侵入，远距离传播则主要通过带菌苗木、接穗和果实。转录激活样效应物（TALEs）与宿主启动子中的效应物结合位点（EBEs），激活下游宿主基因的转录，对Xcc的毒力起到了重要作用。近日美国佛罗里达大学植物病理学系Jeffrey B. Jones课题组在Plant Biotechnology Journal期刊上发表了题为:“A promoter trap in transgenic citrus mediates recognition of a broad spectrum of Xanthomonas citri pv. citri TALEs, including in planta-evolved derivatives”的文章，通过计算机模拟预测TALE蛋白的EBE，利用TALE密码，设计并合成了一个的抗性基因（R基因），称为Xcc-TALE-trap。它由14个串联排列的EBE组成，每个EBE能够自主识别特定的Xcc TALE，并驱动Xanthomonas avrGf2基因的表达，该基因编码一种能诱导植物细胞死亡的细菌效应物。将该基因转入到Duncan葡萄柚后，发现细胞死亡诱导执行器基因avrGf2的转录严格依赖于TALE，并且能够被多种不同的Xcc TALE蛋白激活。对来自不同地区的Xcc菌株进行评估显示，Xcc-TALE-trap介导了对大多数Xcc菌株的抗性。

在没有病原菌的情况下，Xcc-TALE-trap没有表达avrgf2基因，只有当与Xcc306共同接种时才会诱导HR。通过瞬时感染实验，在柑橘叶片中接种Xcc-TALE-trap的构建体，仅当与Xcc306一起接种时才触发HR，而与XccΔ4（缺少4个TALE基因的Xcc306衍生菌株）一起接种时没有触发HR。这表明Xcc-TALE-trap的HR诱导严格依赖于TALE蛋白的存在，因此该转基因体系可以应用于稳定转化到柑橘植物中（图2）。

接种Xcc306菌株后，与携带Xcc-TALE-trap的转基因植株相比，野生型Duncan柑橘植株上的菌体数量在六天和八天的时间点显著减少。八天后，从野生型Duncan植株上获得的菌落数比转基因植株上的数量低近四个数量级，证明了Xcc-TALE-trap对Xcc306的高效抗菌性（图3）。

通过接种携带不同Xcc306 TALE基因的XccΔ4转基因体系，以及携带Xcc TALE基因的XccΔ4转基因体系，研究了Xcc-TALE-trap的识别特异性。结果表明，只有携带Xcc306 TALE基因或Xeu的AvrBs3蛋白的XccΔ4菌株能够在携带Xcc-TALE-trap的转基因植株中触发HR，而携带Xcc TALE基因的XccΔ4转基因体系无法触发HR（图4）。

通过对来自四个大洲（南美洲、北美洲、亚洲和大洋洲）多个国家的10个不同Xcc菌株进行研究，发现Xcc-TALE-trap能够识别和抵抗广谱的Xcc菌株。通过注射和针刺接种实验，除了XccΔ4菌株外，所有Xcc菌株在携带Xcc-TALE-trap的转基因植株中触发HR，而在野生型Duncan柑橘植株上没有触发HR（图5）。接种Xcc306菌株可以显著提高携带Xcc-TALE-trap的转基因植株中avrGf2基因的转录水平。然而，接种XccΔ4或接种介质并不会引起转基因植株中avrGf2基因的转录水平升高。这表明Xcc306 TALE蛋白的存在可以激活Xcc-TALE-trap的转录活性。通过在田间条件下的观察，发现携带Xcc-TALE-trap的转基因植株在几个月的生长期间没有出现柑橘溃疡病症状，而野生型Duncan柑橘植株上出现了中度到严重的病症。这表明携带Xcc-TALE-trap的转基因植株在田间条件下能够提供柑橘溃疡病的抗性。

综上所述，该研究成功构建了Xcc-TALE-trap，并证明其在实验室和田间条件下都能有效抵抗柑橘溃疡病菌Xcc，具有广谱的抗性。通过构建转基因柑橘植株，研究人员成功地引入了一种能够识别溃疡病菌TALE蛋白并触发宿主细胞HR的合成执行子型R基因。该基因的引入使柑橘植株获得了强大的抗病能力，表现出广谱和持久的抗性。这一发现不仅为柑橘抗溃疡病的防控提供了新的方法，还为其他作物的病害防治研究提供了启示。

原文链接：

https://doi.org/10.1111/pbi.14109

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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