导读
高脂肪高果糖饮食（HFFD）是西方社会的一种常见饮食，它会加剧肠道微生物群和胆汁酸（BA）代谢的紊乱。本研究旨在研究枸杞果水提取物（LBE）对HFFD诱导的神经炎症小鼠肠道微生物群和BA代谢的影响。结果表明，补充LBE 14周可显著改善体重增加和胰岛素抵抗，并抑制HFFD诱导的小胶质细胞活化和神经炎症。Morris水迷宫和Y迷宫测试结果表明，LBE减轻了HFFD诱导的认知障碍。此外，LBE提高了肝脏BA的生物合成和BA的排泄，并增加了BA经粪便的清除。补充LBE导致皮层和海马中牛磺脱氧胆酸（TDCA）的富集。此外，16S rDNA测序结果表明，LBE可以调节肠道微生物群的结构，同时降低与BA稳态相关的Clostridium_XlVa的相对丰度。此外，LBE具有神经保护作用，涉及乳球菌的增加，乳球菌是一种潜在的有益菌。这些结果表明，LBE可以通过肠-肝-脑轴改善HFFD诱导的小鼠的神经炎症和认知障碍，这可能是由于BA稳态和小鼠肠道微生物群的调节。
论文ID
原名：Water extract of goji berries improves neuroinflammation induced by a high-fat and high-fructose diet based on the bile acid-mediated gut–brain axis pathway
译名：枸杞水提取物通过胆汁酸介导的肠-脑轴通路改善高脂高糖饮食引起的神经炎症
期刊：Food & Function
IF：6.1
发表时间：2023.08
通讯作者：曹有龙，曾晓雄
通讯作者单位：宁夏农林科学院，南京农业大学
实验设计
实验结果
本研究中制备的LBE由176.63±5.26mg/g LBE水溶性碳水化合物、115.29±3.24mg/g LBE多糖、85.68±3.44mg/g LBE多酚、18.71±0.17mg/g LBE粗蛋白和3.70±0.18mg/g LBE类黄酮组成。此外，LBE含有46.47±3.35mg/g LBE果糖、35.86±3.65mg/g LBE葡萄糖和2.98±0.63mg/g LBE蔗糖。
1.LBE减轻HFFD诱导的肥胖相关行为障碍，抑制体重增加和胰岛素抵抗
为了研究LBE减轻行为功能障碍的作用，小鼠口服LBE（见图1A中的动物方案1）。在提供LBE 14周后，我们进行MWM和Y迷宫测试，以探索HFFD诱导的小鼠的学习和记忆。在训练期间，所有组的平均逃避潜伏期逐渐缩短（p<0.05）。此外，在最后一天，与HFFD组相比，LBE组显示出更短的潜伏期，表明LBE减轻了HFFD诱导的行为功能障碍（图1B和C）。在空间探索测试的第5天，平台被移除。从结果中可以看出，与HFFD诱导的肥胖小鼠相比，LBE组的平台穿越次数、距离百分比和在目标象限花费的时间百分比显著增加（图1D-F，p<0.05），表明补充LBE可以减轻海马依赖性空间学习和记忆。此外，HFFD组的小鼠在Y迷宫测试中表现出自发交替的减少，这表明HFFD损害了空间记忆能力。相反，LBE改善了HFFD诱导小鼠的随机交替行为损伤（图1G，p<0.01）。LBE减少了HFFD诱导的体重增加和附睾脂肪积累（图1H和I），表明LBE干预显著抑制了HFFD诱发的肥胖。补充LBE显著降低了血浆中的空腹血糖水平（图1J）。所有小鼠均接受口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。同样，在0–120分钟的整个时间段内，LBE的给药对血糖浓度有显著影响，AUC显著下降（图1K和L）。总之，这些数据表明，LBE可以改善HFFD诱导的过度脂肪积累、胰岛素抵抗和行为功能障碍。
图1 LBE减轻了HFFD诱导的行为功能障碍，并抑制了体重增加和胰岛素抵抗
（A）动物实验方案。（B）代表性轨迹（空间探索测试）。（C）平均潜伏期（s）和（D）平台穿越次数（空间探索测试）。（E）目标象限中的距离比例。（F）在目标象限中花费的时间百分比。（G）自发交替（Y迷宫）。（H）体重。（I）脂肪细胞大小（附睾白色脂肪组织）。（J）空腹血糖浓度。（K）OGTT。（L）OGTT分析的AUC。数据以平均值±SEM表示，n=8。与NC组相比*p＜0.05和**p＜0.01，与HFFD组相比，#p<0.05和##p<0.01。
2. LBE减轻HFFD诱导的小胶质细胞激活和神经炎症
在我们观察到补充LBE可以改善认知缺陷后，我们进一步验证了LBE对全身炎症、神经元损伤和神经炎症的影响。如图2A所示，HFFD喂养的小鼠血清LPS、TNF-α和IL-6水平显著升高，并通过补充LBE显著逆转（p<0.05）。与NC和LBE组相比，基于H&E染色切片，HFFD诱导的小鼠的CA1、CA3、DG和皮层区域的神经元细胞显示细胞核收缩。与此同时，神经元细胞分散在CA3区域，补充LBE后，神经元在CA3中的分布正常（图2C）。此外，与HFFD组相比，LBE组的TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达显著降低（图2B）。与NC组相比，免疫荧光染色显示，在HFFD喂养的小鼠中，整个海马的离子钙结合衔接分子1（Iba-1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的密度显著增加（图2D）。相反，LBE显著降低了Iba-1和GFAP的平均免疫荧光强度。此外，LBE显著增加了海马突触后密度蛋白95（PSD-95）的平均免疫荧光强度，PSD-95是突触可塑性和突触发生的关键介质。同样，补充LBE后PSD的mRNA表达水平也升高。总之，这些数据证实LBE显著抑制了全身炎症反应和小胶质细胞活化，从而预防了神经炎症。
图2 LBE减轻HFFD引起的全身炎症、小胶质细胞活化和神经炎症
（A）LPS、TNF-α和IL-6水平（n=8）。（B）大脑皮层和海马中TNF-α、IL-6、IL-1β和PSD-95 mRNA水平（n=6）。（C）海马和皮层CA1、CA3和DG中H&E染色的脑组织组织学切片的代表性显微照片（比例尺，50μm）。（D）海马中GFAP、Iba-1和PSD-95的代表性免疫荧光图像和定量分析（n=3）。数据以平均值±SEM表示，n=8。与NC组相比，*p＜0.05和**p＜0.01；与HFFD组相比，#p<0.05和##p<0.01。
3. LBE改变了HFFD诱导小鼠的肝脏和粪便BA代谢谱
补充LBE可逆转HFFD小鼠中以肝脂肪变性为特征的组织学变化，如大泡性脂肪变性、气球样变性和炎症（图3A）。此外，根据油红O染色，HFFD组的肝脏显示出明显的脂质积聚，相反，补充LBE会降低脂质积聚（图3A）。接下来，在本研究中，我们在mRNA水平上评估了肝脏中BA相关基因的合成。与HFFD组相比，LBE显著上调CYP7A1、CYP27A1和成纤维细胞生长因子（FGFR4），FXR和小异二聚体伴侣（SHP）的mRNA水平下调（图3B）。接下来，为了确定LBE对BA的潜在影响，我们研究了肝脏、回肠、盲肠和粪便中的18种BAs。结果显示，LBE组肝脏中总BA的水平，包括未结合的BAs和结合的BAs，显著升高（图3C）。具体而言，牛磺酸偶联的BA，包括牛磺胆酸（TCA）、牛磺-α-鼠胆酸（TαMCA）、牛磺-β-鼠胆酸（TβMCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），在LBE组中显著升高（图3D）。三组回肠内容物中未结合BAs和结合BAs的水平没有显著差异（图S1A和B†）。在补充LBE的小鼠盲肠内容物中，我们还观察到非结合BAs（包括αMCA、βMCA、ωMCA、DCA、UDCA、猪去氧胆酸（HDCA）、CDCA和石胆酸（LCA））和结合BAs（如TCA、TβMCA，TDCA、TCDCA和TUDCA）的显著上调（图S1C和D†）。LBE上调了结肠中紧密连接蛋白（包括ZO-1、claudin-1和occludin）的mRNA水平（图3E）。此外，根据H&E染色，LBE逆转了HFFD组中炎症细胞的轻微浸润（图3F）。在小鼠粪便中，补充LBE显著提高了未结合BAs的水平，如CA、αMCA、βMCA、ωMCA、DCA、UDCA和CDCA，以及结合BAs，如TCA、TβMCA和TUDCA（图3G和H）。总之，这些结果表明补充LBE加速了BA的合成。同时，LBE干预后粪便中BA的总损失显著增加。
图3 LBE减弱HFFD诱导的肝脏和粪便BA代谢破坏
（A）不同组（n=3）肝组织的组织学切片。（B）肝脏中相对mRNA表达水平。（C）LBE对肝脏总BA水平的影响。（D）补充LBE后小鼠的肝脏BA水平和BA谱。（E）结肠中ZO-1、claudin-1和occludin mRNA水平（n=6）。（F）不同组的结肠组织H&E切片（n=3）。（G）LBE对总粪便BA水平的影响（n=8）。（H）补充LBE后小鼠的粪便BA水平和BA谱（n=8）。数据以平均值±SEM表示，n=8。与NC组相比，*p＜0.05和**p＜0.01；与HFFD组相比，#p<0.05和##p<0.01。
4. LBE的补充改变了血清和大脑中的BA池/谱
接下来，为了检测不同组之间的BA差异，我们测量了NC、HFFD和LBE组的血浆BA谱。根据图4A，LBE提高DCA、CDCA和TCDCA的水平。此外，除其他外，LBE组血浆中的CA、βMCA和TUDCA显著低于HFFD组。新出现的数据表明BA在认知和记忆功能中发挥着重要作用，因此我们对血清和大脑中的BA水平进行了评估。皮层BA谱如图4C和D所示，其中LBE显著增加了总BA水平和未结合BAs，特别是CA、βMCA、DCA、UDCA、TDCA和TUDCA。结果显示，海马总BA水平显著升高，最显著的是DCA、TDCA和TUDCA，这与皮层一致。正如预期的那样，在LBE喂养的小鼠海马中，神经保护性TUDCA的量显著增加（图4E和F）。因此，补充LBE缓解了HFFD喂养小鼠BA代谢的失调。
图4 LBE干扰了血清和大脑中BAs池/谱（LBE升高了血浆和大脑中的结合BAs。）
（A）总血浆BA水平（n=8）。（B）补充LBE后小鼠的血浆BA类别和BA谱（n=8）。（C）总皮层BA水平（n=8）。（D）补充LBE后小鼠的皮层BA水平和BA谱（n=8）。（E）海马总BA水平（n=8）。（F）补充LBE后小鼠的海马BA水平和BA谱（n=8）。数据以平均值±SEM表示，n=8。与NC组相比，*p＜0.05和**p＜0.01；#p＜0.05和##p＜0.01。
5. LBE对肠道菌群的影响
我们使用16S rDNA测序评估响应LBE的微生物群落组成。主成分分析（PCA）显示了β-多样性的相对分布特征（图5A）。HFFD显著改变了微生物群落，LBE改变了这些变化。然后，我们在属水平上对微生物结构进行评估。乳球菌、Romboutsia、Enterorhabdus、欧陆森氏菌和葡萄球菌属五个属的相对丰度增加。与HFFD组相比，LBE组中Allobaculum、Eisenbergiella、Mucispirillum、Clostridium_XlVa和Barnesiella的相对丰度增加（图5B–K）。此外，我们建立了随机森林（RF）模型来确定LBE对细菌属的影响。同样，Barnesiella、Eisenbergiella、Clostridium_XlVa和Mucispirillum显示出最高的平均下降准确值，表明它们比其他属具有更显著的影响（图5L）。我们同时采用线性判别分析效应大小（LEfSe）评价LBE组和HFFD组之间的差异，发现HFFD组Clostridium_XlVa（ASV70），Clostridium_sp._ASF502（ASV39）、Anaerovorax（ASV542）、Lachnospiraceae（ASV73）、Lachnospiraceae（ASV54）和Helicobacter_ganmani（ASV19）增加。与HFFD喂养的小鼠相比，在LBE喂养的小鼠中，Coriobacteriaceae（ASV298）、Coriobacteriaceae（ASV25）、Enterorhabdus（ASV16）、Buchnera（ASV211）和Herbaspirillum（ASV342）更丰富（图6A）。与这些发现一致，RF结果表明，Clostridium_XlVa（ASV70）的缺失和Buchnera（ASV211）、Coriobacteriaceae（ASV25）和Coriobacteriaceae（ASV182）的富集可能在LBE喂养小鼠的肠道微生物群中发挥重要作用（图6B）。这些发现表明LBE部分调节HFFD诱导的肠道微生态失调。
图5 LBE减轻了HFFD诱导的肠道微生态失调
（A）肠道微生物群的主成分分析（n=10）。属水平的肠道微生物组成。（B）Clostridium_XlVa、（C）Allobaculum、（D）乳球菌、（E）Eisenbergiella、（F）Enterorhabdus、（G）Mucispirillum、（H）欧陆森氏菌、（I）Romboutsia、（J）Staphylococcus和（K）Barnesiella的相对丰度。（L）RF分析基于平均减少准确度对前15个差异丰富的分类群进行了优先排序。数据以平均值±SEM表示，n=8。与NC组相比，*p＜0.05和**p＜0.01；与HFFD组相比，#p<0.05和##p<0.01。
图6 LBE减轻了HFFD诱导的肠道微生态失调
（A）（a）LDA；（b）在左图中，*和**分别代表两组中更多和更少的ASVs。在右侧图中，ASVs代表细菌分类群信息。使用R软件包进行Tukey的HSD检验（FDR-p<0.05）。（B）RF分析基于平均减少准确度对前15个差异丰富的分类群进行了优先排序。
讨论
西方饮食会显著增加全身炎症，影响肠道微生物群和微生物代谢产物，这与认知健康有关。通过实施饮食介导的干预来调控肠道微生物群稳态和代谢稳态被认为是预防认知能力下降的安全有效的方法。枸杞是一种滋补食品和中药，可显著改善学习和记忆障碍。然而，在HFFD喂养的小鼠中BA代谢是否异常尚不清楚。此外，LBE通过调节BA代谢和肠道微生态来缓解肥胖相关的神经炎症和认知能力下降，也未被清楚地研究。在本研究中，目前的结果表明，LBE通过调节BA代谢稳态和肠道微生物群稳态来减轻HFFD诱导的神经炎症和认知障碍。此外，补充LBE改善了HFFD诱导的小鼠的认知能力下降，这也反映在MWM和Y迷宫测试的学习和空间记忆中。
炎症应激和神经炎症是认知障碍的重要指标。新出现的证据表明，西方饮食会破坏肠道屏障，进而导致LPS的涌入，加剧神经炎症，并可能最终导致神经认知能力下降。具体来说，西方饮食会升高循环中的LPS水平并引发炎症。例如，Jena等人表明，西方饮食增加了肠道通透性，促进了全身炎症和免疫反应，增加了血脑屏障（BBB）通透性，降低了小胶质细胞的激活和神经可塑性，从而导致神经炎症。Wang等人研究了补充番茄红素对HFFD小鼠血清和大脑炎症细胞因子水平的缓解作用。同样，如图2A所示，我们目前的结果表明，LBE在血清中也表现出更好的抗炎作用。此外，西方饮食刺激啮齿类动物产生TNF-α和IL-1β，这已被证明会损害海马依赖性记忆。LBE确实降低了肠道通透性和LPS进入循环，ZO-1、claudin-1和occludin的mRNA表达减少，皮层和海马的神经炎症减少，神经胶质细胞活化受限。
BA是在肝脏中产生的，与各种代谢性疾病密切相关。因果关系尚未完全阐明，但BA及其受体可以调节中枢神经系统（CNS）的神经功能。通常，肝脏中的经典途径由限速酶CYP7A1介导，而替代途径由CYP27A1启动。LBE组CYP7A1和CYP27A1的mRNA水平上调解释了粪便CA、αMCA、βMCA、ωMCA等和总BA含量的增加。特别是，补充LBE可以下调肝脏SHP的mRNA表达，这表明SHP可能是LBE诱导的BA合成中FXR激活介导的成分。
先前的报道表明，脑组织是研究神经退行性疾病的直接和理想的生物标本之一。此外，大脑中的BA，包括非结合BA（CA、αMCA、βMCA、ωMCA、DCA、CDCA等）和结合BA（TCA、TUDCA、TCDCA、TDCA、TαMCA和TβMCA等），在大脑生理学和病理生理学中发挥作用。事实上，多项实验和临床研究证实BA参与了AD的进展和发病机制。越来越多的研究在AD患者的大脑中检测到了所有经肠道微生物群修饰的次级BA，并且次级BA的比例显著增加与AD的认知障碍和神经影像学生物标志物有关。此外，BA存在于脑组织中，其浓度与循环中的BA浓度相关。未结合的BA可以通过被动扩散穿过血脑屏障，但结合的BA可能需要主动转运到大脑中。据报道，在饮食诱导的肥胖（DIO）小鼠中，作为强效TGR5激动剂的DCA下丘脑和血浆水平之间具有显著相关性。同样，LBE组的皮层、海马体和血浆DCA水平显著升高。TUDCA是一种关键的代谢产物，它在中枢神经系统中产生抗炎作用、减少氧化应激和抗凋亡作用。例如，据报道，TUDCA对多发性硬化症（MS）患者的中枢神经系统具有神经保护作用。此外，在动物模型中，TUDCA已被证明具有三重抗神经炎症作用，包括减少单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、抑制小胶质细胞迁移能力和减缓神经胶质细胞活化。正如预期的那样，我们目前的结果表明，LBE组的皮层和海马TUDCA水平显著增加。LBE可在HFFD诱导的小鼠中发挥抗炎作用，这可能是由于皮层和海马中TUDCA的增加。此外，APP/PS1小鼠大脑中的βMCA、ωMCA、TCA和TUDCA较低。同样，在我们目前的研究中，HFFD喂养小鼠的大脑皮层和海马中的βMCA、ωMCA、TCA和TUDCA减少。皮层中的βMCA通过补充LBE而上调。然而，海马中的这些BA都没有增加。因此，这些结果表明LBE可以减轻HFFD小鼠的神经炎症特征，这可能与BA代谢的调节有关。
肠道微生物群在认知功能的发生和发展中发挥着作用。在本研究中，饮食添加LBE可以重塑肠道微生物群，包括Allobaculum、Eisenbergiella、Mucispirillum、Clostridium_XlVa和Barnesiella的相对丰度降低，乳球菌、Romboutsia、Enterorhabdus、欧陆森氏菌和Staphylococcus的相对丰度增加。乳球菌（革兰氏阳性）是乳酸菌中的一个属。特别是，先前的研究表明，乳酸乳球菌乳酸亚种lactis NCDO 2118，和乳酸乳球菌乳酸亚种cremoris FC对结肠炎小鼠具有免疫调节作用。乳酸乳球菌乳酸亚种cremoris LL95是一种益生菌，已被证明在LPS诱导的抑郁样小鼠模型中对海马中的促炎细胞因子表达和氧化应激发挥调节作用。此外，Li等人发现，乳球菌在老年小鼠中的相对丰度较低。因此，LBE对神经炎症和认知能力下降的神经保护作用可能归因于乳球菌的比例增加。
研究表明，BAs和肠道微生物群之间的密切相互作用对神经退行性变有直接影响。BAs塑造肠道微生物群的组成和功能。反过来，BA谱受到微生物胆盐水解酶（BSH）活性的影响。BSH是唯一负责关键去偶联反应的酶，这是之后BA转化的先决条件。先前的报道表明，乳酸杆菌、拟杆菌、梭菌、双歧杆菌和李斯特菌与BSH活性密切相关。先前的一项研究表明，L-茶氨酸可以降低与BSH活性相关的梭菌、乳酸杆菌和链球菌，从而提高回肠中结合BA的浓度，抑制肠道FXR–FGF15信号通路，从而调节雄性BALB/c小鼠的脂质代谢。肠道微生物群还通过7α-脱羟基作用将未结合的BA转化为次级BA（梭菌属）。其他研究者在梭菌属成员中检测到7α/β-羟基类固醇脱氢酶和7α-β-脱羟基作用，表明非结合BAs的差向异构化可能是由梭菌属成员介导的。例如，之前的一项研究表明，双硫仑降低了梭菌介导的7α-脱羟基活性，以抑制次级BA合成，进而激活肝脏FXR信号通路，缓解非酒精性脂肪性肝炎。在这里，LBE干预可以降低富含BSH的细菌属的相对丰度，包括Clostridium_XlVa。这些发现表明，LBE诱导的Clostridium_XlVa相对丰度的降低可能通过去偶联反应和非结合BAs的差向异构化来影响BA谱，从而减轻神经炎症和认知障碍。
结论
总之，我们的研究结果表明，饮食LBE对HFFD诱导的认知障碍具有保护作用。此外，LBE恢复了肠上皮屏障损伤，降低了循环LPS水平，并抑制了皮层和海马的神经炎症。此外，在LBE对BA合成的调节中，肝脏BA的产生和粪便排泄增加。此外，补充LBE导致皮层和海马中TUDCA的富集，这已被证明具有抗炎作用。LBE还重塑了肠道微生物群，导致BA代谢产物的改变，这可能是HFFD诱导小鼠的抗炎活性的原因。总之，这些结果表明，LBE可以通过肠-肝-脑轴改善HFFD诱导的认知障碍，这为减轻肥胖相关的神经炎症提供了新的见解。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37670564/
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