导读
糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾功能衰竭的主要原因，也是糖尿病（DM）患者常见的微血管并发症。毛蕊花糖苷（ACT）是从地黄叶中提取的主要成分，具有入肺、润肤止痒、滋阴补肾、凉血止血等功效。ACT因其对糖尿病及其并发症的治疗效果而引起了全世界的关注。本研究旨在基于代谢组学和网络药理学研究，阐明ACT在db/db小鼠中的代谢谱和靶点。我们用db/db小鼠观察肾脏生化指标和组织病理学变化，评价ACT对DN的药理作用；通过UHPLC-LTQ-Orbitrap MS对尿液、血清和肾脏样本进行非靶向代谢组学研究；通过网络药理学分析了关键靶点和途径；对于非靶向代谢组学富集的途径，我们在肾脏样本中进行UHPLC-QQQ-MS/MS靶向代谢组学验证，并对肾脏样本中的灵敏生物标志物进行了评估；从体内小分子代谢的角度描述了ACT对DN改善的作用。ACT可延缓DN的进展，改善肾脏的组织病理学损伤程度。网络药理学分析揭示，其作用途径与信号转导、碳水化合物、脂质、氨基酸代谢有关，主要影响内分泌和免疫系统。db/db小鼠肾脏中的氨基酸代谢受到干扰，ACT可显著回调如色氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺等氨基酸的水平。总之，本研究为ACT在临床治疗DN的可能性提供了支持。
研究热点：
1. db/db小鼠肾脏的氨基酸代谢受到干扰，ACT可对其进行调节；
2. 通过UHPLC-LTQ-Orbitrap MS对尿液、血清和肾脏样本进行非靶向代谢组学研究；
3. 通过网络药理学分析研究了ACT治疗DN的潜在治疗靶点；
4. 通过UHPLC-QQQ-MS/MS在肾脏样品中进行靶向代谢组学验证。
论文ID
原名：Altered metabolic profiles and targets relevant to the protective effect of acteoside on diabetic nephropathy in db/db mice based on metabolomics and network pharmacology studies
译名：基于代谢组学和网络药理学研究的db/db小鼠中与毛蕊花糖苷对糖尿病肾病保护作用相关的代谢谱和靶点改变
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.08
通讯作者：赵海誉，赵巍，司南
通讯作者单位：中国中医科学院，国家药品监督管理局
实验设计
实验结果
1. 小鼠一般情况
正常（Con）组小鼠整体状态良好，行动敏捷。在模型（Mod）组中，小鼠情绪低落，活动减少，灵活性减弱。各治疗组小鼠的上述情况均得到改善。Mod组小鼠的增重值显著高于Con组（P＜0.001）。给药8周后，ACT组小鼠的体重增加值显著小于Mod组（P<0.05）（图1A）。Mod组的饮水量明显高于Con组（P<0.05）。给药后，Mod组和各给药组之间没有显著差异（图1B）。糖耐量结果显示，Mod组与Con组之间有显著性差异（P<0.05），而Mod组和其他组之间无显著性差异。
图1 ACT对DN小鼠的治疗作用
（A）不同组小鼠体重增加8周。（B）各组小鼠的食物摄入量和饮水量。（C）各组小鼠的尿微量白蛋白/肌酐比值（UmACR）。（D）肾组织HE染色（×200）。（E）肾组织PAS染色（×400）。（F）肾组织Masson染色（×400）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，*****P<0.0001（与Mod组相比）。
2. ACT对DN小鼠的治疗作用
尿液生化指标结果显示，Mod组24小时尿微量白蛋白（总mALB）和尿微量白蛋白/肌酐比值（UmACR）显著高于Con组（P<0.05）。在厄贝沙坦（Irb）和ACT组中，UmACR水平低于Mod组（图1C）。
HE染色结果显示，Con组肾小球无肥大，毛细血管基底膜无增厚，系膜基质无增生，肾小管上皮无变性坏死，间质无炎性细胞浸润。Mod组肾小球中度肥大，肾小球囊腔变窄甚至出现腔隙，系膜面积明显加宽，系膜基质增加，如绿色箭头所示；毛细血管基底膜不同程度增厚，如黑色箭头所示；一些肾小管结构紊乱，上皮细胞肥大、空泡化，如黄色箭头所示；或颗粒变性，一些动物肾小管中的单个细胞坏死（如蓝色箭头所示）；间质炎性细胞浸润（如紫色箭头所示）；与Con组比较有显著性差异（P<0.01）。与Mod组相比，Irb组的这些病变略有减少。ACT组肾小球轻度肥大，基底膜和系膜基质轻度增生，如红色和绿色箭头所示。管状上皮细胞局部空泡化，如黄色箭头所示，与模型组相比有减少的趋势（P＜0.1）。这些
如图1D所示。
PAS染色结果显示，Con组肾小球结构完整，无系膜增生。Mod组肾小球变宽，系膜基质增生，肾小球毛细血管管腔变窄，基底膜增厚。与Con组相比，Mod组肾脏PAS糖原面积比显著增加（P<0.01）。与Mod组相比，Irb组和ACT组的PAS糖原面积比显著降低（P<0.05，P<0.01）。这些现象如图1E所示。
Masson染色结果显示，Con组肾小球和小管结构正常。在Mod组中，肾小球系膜区胶原增殖明显多于Con组。肾小管间质组织中的胶原组织增生明显增多。Irb对db/db小鼠肾小球间质和肾小管间质胶原沉积具有调节作用。给予ACT干预可以显著减少db/db小鼠肾小球和肾小管间质中的胶原沉积（P<0.05），如图1F所示。
图2 差异代谢物分析
（A）正离子和负离子模式下Con、Mod、ACT组血清、4周尿液、8周尿液以及肾脏样本的PCA。（B）使用MetaboAnalyst可视化的Con和Mod组之间4周尿液样本中差异代谢物的代谢途径。（C）使用MetaboAnalyst可视化的Con和Mod组之间8周尿液样本中差异代谢物的代谢途径。（D）Con、Mod和ACT组肾脏样本中差异代谢物的代谢途径。
3. 代谢谱的多变量分析
为了进一步探索ACT对DN保护作用的潜在机制，我们进行了非靶向代谢组学研究。为了最大限度地增加信息量，我们以正和负离子模式采集了血清、尿液和肾脏样本的特征。在正离子模式下，我们在血清、尿液和肾脏样本中鉴定出55328和196种代谢物。在负离子模式下，我们在血清、尿液和肾脏样本中鉴定出52、879和51种代谢物。
主成分分析显示出组分离的趋势。无监督主成分分析和具有代表性的总离子色谱图（TICs）表明，QC样品在该过程中表现稳定。此外，PCA评分图（图2A）显示，对于正离子模式和负离子模式，三组明显相互分离。这表明不同组的代谢物发生了显著变化，与生理指标的出现一致。正离子模式下第一主成分（PC1）解释了血清、4周尿液、8周尿液和肾脏样本中原始数据集的96.13%、91.81%、91.32%和93.41%的特征。负离子模式下PC1解释了98.83%、94.93%、92.93%和93.49%的原始数据集的特征。
Con和Mod组在正离子模式和负离子模式下的OPLS-DA模型图是明显可区分的。结果表明，db/db小鼠的内源性物质代谢受到明显干扰，可以利用代谢谱筛选生物标志物。在正离子模式下，Con组和Mod组的OPLS-DA中R2Y和Q2的参数分别为0.987和0.909，0.99和0.938，0.996和0.959。在负离子模式下，Mod组和ACT组的OPLS-DA中R2Y和Q2的参数在血清样本中分别为0.997和0.677，在4周尿液样本中分别是0.989和0.156，在8周尿液样本中分别是0.99和0.515，以及在肾脏样本分别为0.98和0.842。在负离子模式下，Con组和Mod组的OPLS-DA中R2Y和Q2的参数在血清样本中分别为0.99和0.759，在4周尿液样本中为0.991和0.956，在8周尿液样本为0.995和0.963，在肾脏样本中为0.986和0.824。在负离子模式下，Mod和ACT组的血清样本中OPLS-DA中R2Y和Q2的参数分别为0.993和0.553，4周尿液样本中R2Y参数分别为0.969和0.752，8周尿液样本为0.992和0.879，肾脏样本为0.891和0.78（图S1–S3）。我们发现，在正离子模式下，ACT组和Mod组在4周时的尿液样本没有显著差异，但在8周时有显著差异。OPLS-DA模型合格。这表明，时间越长，ACT组和Mod组之间的尿液样本差异就越显著。
图3 ACT-DN靶点的筛选和富集分析
（A）122个DN和ACT之间的重叠基因符号。（B）PPI网络分析。（C）PPI网络中的模块。（D）KEGG富集分析的前20条途径。（E）GO富集分析。
4. 代谢途径分析
基于变量投影重要性（VIP）>1，倍数变化（FC）>1.5或<0.7，以及P<0.05，我们将代谢产物过滤为差异代谢产物。为了探索ACT在db/db小鼠中的代谢途径，我们将差异代谢产物导入MetaboAnalyst 5.0。如图2B所示，在Con组和Mod组之间的4周尿液样本中，通路受到显著影响，包括嘧啶代谢、氨酰基tRNA生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。如图2C所示，Con组和Mod组之间8周尿液样本中的通路受到显著影响，包括嘧啶代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨酰基tRNA生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、β-丙氨酸代谢。
结果显示，ACT处理后，与氨基酸代谢相关的途径发生了显著变化。尿液中受影响的途径包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢。肾脏中受影响的途径包括嘌呤代谢、精氨酸生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、β-丙氨酸代谢、赖氨酸降解（图2D）。
图4 化合物-反应-酶-基因-网络的关键代谢产物和靶点
5. 网络药理学分析
我们从PharmMapper和Swiss Target Prediction数据库中总共提取了293个ACT靶点，在选择并消除冗余后，获得了1748个DN靶点（见图3A），共有122个交叉靶点。图S4简要说明了网络药理学分析的过程。KEGG通路涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、FoxO信号通路、内分泌抵抗、MAPK信号通路、胰岛素抵抗、PI3KAkt信号通路和IL-17信号通路（图3D）。
结果共有143个节点（122个靶点和20个通路）和477个边。“成分-靶点-通路”网络如图S5所示。在该网络中，靶点如AKT2、AKT1、MAPK1、HRAS、MAPK10、EGFR、MAPK8、MAPK14、IGF1R和SRC位于关键网络。这一结果表明，ACT可能协同作用于这些靶点，具有药理作用。这些通路与信号转导具有高度的相关性。ACT与碳水化合物、脂质和氨基酸代谢有关，主要影响内分泌和免疫系统。本研究初步探索ACT治疗DN的作用机制，为后续药理实验提供指导。
图5 肾脏样本的靶向代谢组学分析
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，*****P<0.0001（与Mod组相比）
6. 化合物-反应-酶-基因网络构建
为了全面了解ACT对db/db小鼠的治疗效果，我们在图4中基于代谢组学和网络药理学构建了一个相互作用网络。通过匹配Medscape中的潜在基因和差异内源性代谢产物，我们选择了关键靶点，如AKT2、AKT1、MAPK1、HRAS、MAPK10、EGFR、MAPK8、MAPK14、IGF1R和SRC。相关的关键代谢产物有腺嘌呤、亮氨酸、尿嘧啶、腺苷、精氨酸等。尿素循环和精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺的代谢，酪氨酸代谢、色氨酸代谢、嘧啶代谢、磷脂酰肌醇磷酸代谢、嘌呤代谢、赖氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸代谢是受影响的途径。
图6 基于靶向代谢组学分析的代谢物受试者工作特性（ROC）曲线
（A）肾脏样本中Con和Mod组之间代谢物的ROC曲线。（B）肾脏样本中Mod和ACT组之间代谢物的ROC曲线。
7. 靶向代谢组学分析结果
对于非靶向代谢组学富集的途径，我们在肾脏样本中进行UHPLC-QQQ-MS/MS靶向代谢组学验证。与代表整个生物体平均代谢状态的生物流体相比，组织样本在确定器官特异性代谢指纹方面具有优势。ACT可显著回调肾脏代谢产物水平，如苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺、尿素、犬尿酸、色氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸、AMP和NAD+。ACT可显著降低尿苷、5-羟基吲哚-3-乙酸、甲硫氨酸、胆碱和氧戊二酸的水平，同时增加琥珀酸和乳酸的水平（见图5）。
为了评估代谢物标志物的鉴别效力，我们在验证组中进行了进一步的受试者操作特征（ROC）曲线分析。结果表明，包括NAD+、AMP、尿素、犬尿酸、色氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺在内的15种代谢产物标志物在Con组和Mod组之间表现出优异的诊断能力。如图6所示，肾脏中的15种代谢产物标志物具有高灵敏度和特异性，曲线下面积（AUC）为0.711或更大。因此，它们可能是检测DN肾损伤的合适代谢产物，特别是丝氨酸和天冬酰胺在肾脏中表现出显著的分辨能力。
图7 差异代谢产物的关系图
讨论
DN是糖尿病的主要并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因。DN的主要原因是在慢性高糖环境中肾小球微血管结构和功能受损，这通常被认为是环境和遗传因素的结果。代谢失调已成为发病机制中的一个重要标志。
氨基酸存在于广泛的生物体和调节代谢的活性信号分子中。氨基酸参与了糖酵解和三羧酸循环等关键生物过程，氨基酸代谢在生物体的每一个细胞代谢中都很活跃，不仅在蛋白质合成中，在核酸和脂质的合成中也是如此。氨基酸代谢是生物体内细胞代谢的一个关键过程。氨基酸代谢失调也是T2D的致病危险因素。支链氨基酸（BCAA）是具有蛋白质合成特性的必需氨基酸，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。最近，对BCAA在促进胰岛素分泌和预测DN中的作用的研究激增。芳香氨基酸是具有芳香环的氨基酸，包括酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。苯丙氨酸和酪氨酸结构相似。体内苯丙氨酸羟化酶催化酪氨酸生成苯丙氨酸。研究人员发现，BCAA（异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸）和芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）的组合预测了未来患糖尿病的风险，亮氨酸、缬氨酸和酪氨酸以及芳香族氨基酸的苯丙氨酸在预测未来患糖尿病风险方面发挥着关键作用。这五种氨基酸与未来糖尿病的发展高度显著相关。一项研究表明，给小鼠喂食补充苯丙氨酸的饮食可显著诱导胰岛素抵抗和T2DM表型。在我们的研究中，肾脏样本中的苯丙氨酸水平显著升高，ACT可以显著恢复苯丙氨酸水平。
另一项基于小鼠饮食中补充亮氨酸的研究表明，在饮食中添加亮氨酸还可以降低胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性和早期DN发展。也有人认为，在没有进展为DN的T2DM早期，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的水平比正常水平升高。相反，在DN阶段，BCAA显著降低，这表明BCAA反应性在T2DM的早期阶段升高，以抵消高糖毒性，并且在进展为DN的过程中，肾脏病理变化导致BCAA水平降低，BCAA缺乏进一步加剧了BCAA的进展。在这项研究中，肾脏样本中的亮氨酸水平显著升高，ACT可以显著恢复。
研究表明，糖尿病前期和糖尿病患者的支链氨基酸和芳香族氨基酸水平高于正常人，其机制可能与循环氨基酸对胰岛素功能的调节有关。此外，血浆氨基酸水平受肾脏调节的影响，肾脏在氨基酸的合成、降解、转化和肾小管重吸收中发挥着重要作用。慢性肾功能衰竭可显著影响血浆芳香族氨基酸水平。
鸟氨酸与氨和二氧化碳结合产生瓜氨酸，瓜氨酸又与氨结合产生精氨酸，水解后重新形成鸟氨酸并产生尿素，即众所周知的尿素循环。两项独立的横断面研究结果表明，血浆瓜氨酸水平与DN风险相关。精氨酸和鸟氨酸的比例与DN风险之间没有显著相关性。然而，Abdelsattar显示，在DN的早期，血液中的精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸水平显著升高，其中精氨酸最为显著。这与我们目前的实验结果一致。同时，ACT可以显著降低肾脏中的精氨酸水平。
色氨酸作为芳香族氨基酸之一，是人体必需的氨基酸，在人类健康和疾病中起着至关重要的作用。它主要通过犬尿氨酸途径分解代谢，产生犬尿酸、黄尿酸和喹啉酸。这种代谢途径参与免疫激活和炎症的调节，并与肥胖和胰岛素抵抗有关。一项病例队列研究表明，色氨酸与更高的T2D发病风险有关，随着糖尿病的严重程度，色氨酸水平最初可能会增加，然后逐渐减少。这与我们的研究结果一致。在我们的研究中，肾脏样本中的色氨酸水平显著增加，ACT可以显著恢复色氨酸的水平（见图7）。
天冬酰胺与天冬氨酸的高比例与T2D的风险升高有关。在我们的研究中，db/db小鼠的天冬酰胺水平高于正常小鼠。然而，其他研究表明，天冬酰胺与糖尿病风险较低有关。天冬酰胺水平与糖尿病之间的关系在临床上仍然存在争议。还需要进一步的研究来研究糖尿病患者天冬酰胺的变化模式。研究表明，组氨酸产生的微生物代谢产物丙酸咪唑可能参与T2DM的发病机制。在我们的研究中，ACT可以显著恢复肾脏样本中组氨酸的水平。
在高脂饮食喂养和链脲佐菌素（STZ）处理的DN大鼠肾脏中，肾外髓质的AMP和GMP水平显著降低，但肾皮质的AMP和GMP-水平升高。然而，肾皮质和髓质外侧的ADP和ATP水平显著升高。在我们的研究中，Mod组肾脏中的AMP水平显著降低，服药后病情明显好转，这可能与肾功能亢进的改善有关。氨基酸代谢在肾脏代谢中起着重要作用，它不仅代表了肾脏的基本能量来源，而且调控着肾脏的基础代谢。本研究发现DN中的氨基酸代谢受到干扰，ACT可能会对其进行回调。然而，这些发现需要通过实验进一步证实。
结论
本研究采用代谢组学和网络药理学研究方法，探讨ACT改善DN的机制。我们用db/db小鼠观察肾脏生化指标和组织病理学变化，评价ACT对DN的药理作用；通过UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS对尿液、血清和肾脏样本进行非靶向代谢组学研究；通过网络药理学分析了关键靶点和途径。对于非靶向代谢组学富集的途径，我们在肾脏样本中进行UHPLC-QQQ-MS/MS靶向代谢组学验证；对肾脏样本中的灵敏生物标志物进行了评估；从小分子体内代谢的角度描述了ACT对DN改善的作用。
ACT可延缓DN的进展，改善肾脏的组织病理学损伤程度。与氨基酸代谢相关的途径被非靶向代谢组学所验证。通过网络药理学分析，其作用途径与信号转导、碳水化合物、脂质和氨基酸代谢有关，主要影响内分泌和免疫系统。db/db小鼠肾脏中的氨基酸代谢受到干扰，ACT可对其进行回调，如色氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬酰胺。这些代谢产物可能是检测DN肾损伤的合适代谢产物。总之，本研究为ACT治疗DN的临床提供了宝贵的见解和支持。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37619856/
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